BC Proteine

Hydrophober Kollaps Modell

• Frühe Zusammenlagerung hydrophober Reste

• Schnelle Kompaktierung („molten globule“)

• Hydrophober Effekt als Haupttriebkraft

• Vorteil: erklärt schnelle Anfangsphasen der Faltung

• Nachteil: erklärt nicht, wie spezifische Sekundärstrukturen entstehen

Was ist ein Westernblot und wieso werden 2 verschiedene Antikörper zur Detektion verwendet ?

• es ist eine Methode mit der spezifische Proteine einer komplexen Probe nachgewiesen wird.

• das verfahren kombiniert die Trennung von Proteinen nach ihrer Größe mittels gelelektrophorese unter Verwendung von Antikörper

Schritte nach SDS Page

• Proteintransfer : Übertragung der Proteine aus dem Gel auf einen Membran

• Blockierung: unspezifische bindungsstellen der Membran werden blockiert

• Primärantikörper Inkubation: bindet spezifisch an das Zeilprotein

• Waschen: entfernt ungebundenes Antikörper

• Sekundärantikörper: bindet an den primärantikörper

• Detektion: enzymatisch oder Flourszent

Warum 2?

• primärantikörper erkennt spezifisches Zielprotein

• Sekundärprotein: Sgnalverstärkung

• Universell einsetzbar für viele primärantikörper

Vergleichen Sie energieidagramme einer unakatalysierten, einem katalysierten ( komplementär zum Übergangszustand und einer die komplementär zum Substrat ist

Unkatalysiert:

• hohe aktivierungsnergie

• Langsame Reaktion

• Enzym katalysiert:

• Stärkste Absenkung der AE

• Übergangszustand wird stabilisiert

• Schnellste Reaktion

• Enzym komplementär

• Übergangszustand cheered erreichbar

• Stabilisiert das Substrat zu stark

• Geringe Katalyse

Enzyme sind komplementär zum Übergangszustand nicht zum Substrat

Welche Aussage zu enzymatisch katalysierten Reaktionen ist nicht korrekt?

a. Enzyme verringern die Aktivierungsenergie einer Reaktion

b. Enzyme führen sterische Spannung in ein Substrat ein

c. Enzyme stellen eine Umgebung her, wodurch Reaktionen schneller ablaufen

d. Enzyme verschieben das Gleichgewicht zur Edukt-Seite

e. Mit Papain können Antikörper in drei Fragmente getrennt werden

D

Was sind Ribozyme und Abzyme und wie unterscheiden sich diese von anderen Enzymen? Nennen Sie

je zwei Beispiele.

Ribozyme

• Enzyme aus RNA

• Katalytisch aktive RNA-Moleküle

Beispiele:

Ribosom (Peptidyltransferase-Zentrum)

• RNase P

Abzyme

Katalytisch aktive Antikörper

• Erkennen den Übergangszustand

Beispiele:

Esterase-Abzyme

• Protease-Abzyme

Unterschied zu klassischen Enzymen:

• Nicht proteinbasiert (Ribozym)

• Künstlich erzeugt (Abzym)

Nennen Sie vier Mechanismen der Enzymkatalyse mit je einem Beispiel.

1. Säure-Base-Katalyse
   → Histidin in Chymotrypsin

2. Kovalente Katalyse
   → Serin in Serinproteasen

3. Metallionen-Katalyse
   → Zn²⁺ in Carboanhydrase

4. Nähe & Orientierung
   → Hexokinase bindet Glucose und ATP optimal

Welche Aussage ist nicht korrekt?

a. Metallionen können in Enzymen als Cofaktoren dienen.

b. Die Einschränkung der Mobilität/Flexibilität der Reaktanden und ihre korrekte Orientierung

durch Enzyme hat keinen Einfluss auf die Reaktionsrate.

c. Ein Histidin-Rest kann als allgemeine Base bei der Enzymkatalyse wirken.

d. Ein Histidin-Rest kann als allgemeine Säure bei der Enzymkatalyse dienen.

e. Das Substrat wird während der Katalyse im aktiven Zentrum des Enzyms gebunden.

B

Die nachfolgende Proteinsequenz wird mit den Proteasen Chymotrypsin und Trypsin behandelt.

Welche Peptidsequenzen sind nach dem Verdau zu erwarten? Erklären Sie, warum die Proteasen

unterschiedlich wirken.

• Trypsin: spaltet nach Lys (K) und Arg (R)

• Chymotrypsin: spaltet nach aromatischen AS
  

  • Phenylalanin (F)

  • Tyrosin (Y)

  • Tryptophan (W)

Erwartete Peptide

Trypsin: Schnitte hinter K/R → viele kurze Peptide

• Chymotrypsin: Schnitte hinter F/Y/W → andere Fragmentlängen

Warum wirken sie unterschiedlich?

Unterschiedliche Substratbindungstaschen

• Trypsin: negativ geladen → bindet K/R

• Chymotrypsin: hydrophob → bindet aromatische Seitenketten

Bei Chymotrypsin handelt es sich um eine Serin-Protease, was bedeutet dies? Erklären Sie die katalytische

Triade

Serin-Protease bedeutet:

• Serin ist das nukleophile Zentrum der Katalyse

Katalytische Triade

• Ser195: Nukleophiler Angriff

• His57: Protonenübertragung (Säure/Base)

• Asp102: Stabilisiert Histidin

Funktion:

• Aktiviert Serin

• Ermöglicht Peptidspaltung

• Stabilisiert Übergangszustand

Welche Nukleoside sind das ?

Adenin und Thymin

Welche nukleoside sind das ?

Guanin und cytosin

Nukleosom

grundlegende Struktureinheit des Chromatins in eukaryotischen Zellen, bestehend aus einem etwa 147 Basenpaare langen DNA-Abschnitt, der sich ungefähr 1,65-mal um einen Proteinkern aus acht Histonen (dem Histonoctamer) wickelt, ähnlich einer Perlenkette, was die DNA-Verpackung im Zellkern ermöglicht und reguliert. 

Nukleus

Zellkern

Nucleolus

dichte Struktur innerhalb des Zellkerns eukaryotischer Zellen, die hauptsächlich für die Synthese und den Zusammenbau von Ribosomenvorstufen (rRNA und ribosomale Proteine) verantwortlich ist

Ligand

Moleküle, Ionen oder Atome, die sich an ein zentrales Atom (in der Chemie) oder ein Zielprotein (in der Biochemie, z. B. einen Rezeptor) anlagern, um Komplexe oder spezifische Bindungen zu bilden

Welche Aussage ist nicht korrekt?

1. Das Induced Fit-Modell beschreibt die konformationelle Änderung eines Proteins nach
   Ligandenbindung

2. Bei homotropen Interaktionen findet eine wechselseitige Beeinflussung zwischen gleichen
   Liganden statt

3. Bei heterotropen Interaktionen findet eine wechselseitige Beeinflussung zwischen unterschiedlichen Liganden statt

4. Allosterische Proteine besitzen nach einer Ligandenbindung veränderliche Affinitäten zu einem weiteren Liganden

5. Allosterische Proteine weisen nie eine sigmoidale Sättigungskurve auf

5) es ist typisch

P ist ein monomeres Protein mit einer Bindungsstelle pro Molekül für den Liganden L.
Es bindet den Liganden L mit einer Assoziationskonstante Ka von 106 M-1. Skizzieren Sie die Bindungskurve für die Bindung des Liganden L an das Protein P in einem Diagramm, in dem sie den Sättigungsgrad & gegen steigende Konzentration des Liganden L auftragen. Die Bindungskurve soll die Affinität zwischen Protein P und Ligand L korrekt widerspiegeln.

Steiler Anstieg bei niedriger L

Halbsättigung bei KD 1/ K a = 10^-6 M

Hohe Affinität = frühe Sättigung

Erklären Sie den Begriff der Kooperativität und erläutern Sie, welche Parameter die Struktur des Hämoglobins und damit seine Affinität beeinflussen.

Kooperativität

Definition

Bindung eines Liganden beeinflusst die Affinität weiterer Bindungsstellen

Hämoglobin

• Tetramer (α₂β₂)

• Positive Kooperativität

• S-förmige (sigmoidale) Bindungskurve

T- und R-Form

• T-Form: niedrige Affinität

• R-Form: hohe Affinität

Affinitätsmodulatoren

• pH (Bohr-Effekt)

• CO₂

• 2,3-BPG

• O₂-Partialdruck

Skizzieren Sie Immunglobulin G. Ordnen Sie folgende Bestandteile zu: CH, CL, VH, VL, N-/C-Terminus, antigen-bindendes Fragment, kristallisierbares Fragment, Antigen-Bindestelle. Mit welchem Enzym lassen sich gezielt beide Fragmente trennen?

Ein Meilenstein in der Proteinforschung ist Affinsens Experiment zur Renaturierung von Proteinen.
Welche der folgenden Aussagen ist nicht korrekt?

1. Harnstoff und Mercaptoethanol zerstören nicht kovalente Wechselwirkungen.

2. Die denaturierte und reduzierte Form der Ribonuklease A zeigt keine Aktivität.

3. Die 3D-Struktur ist durch die Sequenz bestimmt und wird für die Proteinaktivität benötigt.

4. Katalytische Mengen von Mercaptoethanol sind von Vorteil, um die desaktivierte Ribonuklease A wieder in ihre native Form zu überführen.

5. Die native Form des Enzyms ist die Form der katalytischen Aktivität.

4) Mercaptiethanol muss vollständig entfernt werden, sonst werden disulfidbrücken nicht korrekt gebildet

Gro EL und Gro ES

Falsch gespaltetes Substratprotein bindet an die hydrophoben Bereiche in der inneren Oberfläche der offenen Gro EL zusammen mit ATP

GroES Klappe schließt und bildet ein Käfig

Im Käfig wird die Umgebung Hydrophil, was das Protein zum korrekten Falten bringt

Die hydrolyse von ATP führt zum Abbau des GRO ES EL

DNA K und DNA J System

DNA J erkennt hydrophobe Sequenzen

Hilft bei der Faltung von neuen Proteinen oder teilweise gefalteten

Essentiell fürs überleben unter Hitze, Dehydrierung

DNA K bindet an das Substrat und hydrosiert ATP

Was ist Renautierung ?

die Rückkehr von Biomolekülen (wie Proteinen oder DNA) in ihre ursprüngliche, funktionale dreidimensionale Struktur, nachdem sie durch Denaturierung (Hitze, Säure) ihre Form verloren haben

• Framework Modell

• Zuerst Bildung von α-Helices & β-Faltblättern

• Danach Zusammenlagerung zur Tertiärstruktur

• Vorteil: erklärt gezielte Bildung von sekundärstrukturen

• Am besten arbeiten beide zusammen

Eine Methode zur Messung der Schmelztemperatur eines Proteins besteht darin es mit einem Fluorophor zu inkubieren und die Temperatur schrittweise zu erhöhen. Der Farbstoff zeigt dabei nur in einer hydrophoben Umgebung ein Fluoreszenzsignal. Zeichnen sie ein Diagramm, in dem die Messwerte der Fluoreszenzintensitäten eines solchen Experiments aufgezeichnet wurden und kennzeichnen sie die Schmelztemperatur. Wie ist diese definiert?

Ein Flourophor bindet nur an hydrophobe Bereiche

Im nativen Protein sind sie meist verborgen → geringe Fluoreszenz

Beim erhitzen entfaltet sich das Protein → hydrophobe Bereiche werden exponiert → Fluoreszenz steigt

Schmelztemperatur: Tm= T bei der 50% des Proteins denaturiert sind

Entspricht dem Wendepunkt der Kurve

Was sind chaperone ?

Sie verhindern Aggregation fehlgefalteter Proteine

– neusynthese

– Stress ( Hitze)

– Renautierung