Nukleotidai

Pirimidinas

heterociklinis organinis junginys, panašus į benzeną ir piridiną, turintis du N atomus 1 ir 3 šešianario žiedo pozicijose

Citozinas (Cyt, C)

Uracilas (Ura, U)

RNR

Timinas (Thy, T)

DNR

Purinas

heterociklinis aromatinis junginys, susidedantis iš pirimidino žiedo, konjuguoto su imidazolo žiedu.

Adeninas (Ade, A)

Guaninas (Gua, G)

Nukleozidai

N-heterociklinė bazė + pentozė (beta-N-glikozidinys ryšys)

(-idinas) - įeina pirimidino bazė;

(-ozinas) - įeina purino bazė.

Nukleotidai

nukleozidų ir fosforo rūgšties esteriai. Fosforilo grupė gali būti prijungta prie hidroksigrupių, esančių prie 2’,3’,5’ C atomų.

Nukleobazių santykis DNR

Chagraff’o tasyklė:

• A=T

• G=C

• A+G=T+C

Pentozės

• RNR sudėtyje yra ribozė;

• DNR sudėtyje yra deoksiribozė;

• Nukleotiduose vyrauja beta-furanozės forma;

• Pentozės anglies atomai RNR ir DNR sudėtyje žymimi štrichais, siekiant atskirti juos nuo heterociklinių azoto bazių atomų.

Ribofuranozės žiedo voko konformacija

• Dažniausiai pasitaikanti;

• Priklausomai nuo pakaitų, gali turėti twisted konformaciją;

• Voko konformacijoje 4/5 žiedo atomų yra vienoje plokštumoje (2’ endo ir 3’ endo);

• 3’ endo (North) - pasireiškia RNR ir A formos DNR;

• 2’ endo (South) - B formos DNR

Ribofuranozės žiedo twisted konformacija

• Tokią konformaciją nulemia pakaitai;

• Trys atomai yra vienoje plokštumoje (2' endo 3' exo ir 3' endo 2' exo)

Nukleozidų ypatumai

• baltos, kristalinės, prastai vandenyje tirpios medžiagos;

• struktūroje esančios heterociklinės bazės sugeria UV;

• sugerties spektrai charakteringi kiekvienai bazei;

• sugertis priklauso nuo tirpalo pH, nes kinta bazių jonizacija, nuo to priklauso sugertis.

Nukleozidų anomerai

• beta-nukleozidai - “cis” - gamtiniai;

• alfa - nukleozidai - “trans”.

Nukleozidų glikozidinis ryšys

Piridino N1 / Purino N9 + Pentozės C1’ atomai

Nukleozidų konformacija

• Dėl sterinių trukdžių vyrauja anti

Kiti nukleotidai - nukleozidų fosfatai

• ATP;

• GTP - dalyvauja baltymų sintezėje;

• CTP - dalyvauja lipidų sintezėje;

• UTP - dalyvauja sacharidų metabolizme.

Cikliniai nukleotidai

• cAMP - 3’,5’-adenozinmonofosfatas, veikia kaip metabolitinis reguliatorius bakterijose, grybuose dalyvauja ląstelių susikalbėjime;

• cGMP - 3’,5’-guanozinmonofosfatas.

• Bendrai - antrinės signalinės molekulės.

NAD+ (nikotinamido adenino dinukleotidas)

oksidacijos ir energijos išgavimo reakcijos, ADP ribulozės donoras

NADP+ (nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas)

redukcijos reagentas, anti-oksidacinės reakcijos

FAD (flavino adenino dinukleotidas)

redokso reakcijos, energijos išgavimas

KoA (kofermentas A (CoA coenzyme A)

svarbus aktyvuoti karboksirūgštis - riebalų rūgščių sintezė arba energijai išgauti

Nukleotidų cheminės savybės

• Tautomerizacija;

• Rūgštinės-bazinės savybės;

• Elektrofilinės reakcijos;

• Nukleofilinės reakcijos.

Tautomerizacija

Tautomerai - dinaminėje pusiausvyroje egzistuojantys funkciniai izomerai;

Tautomerizacija - izomerija, kai izomerai (tautomerai) lengvai virsta vienas kitu.

Rūgštinės-bazinės savybės

Nepaisant pavadinimo, tiek bazinės, tiek rūgštinės savybės silpnos, o fiziologinėmis sąlygomis nukleobazės neutralios.

Pirimidinų halogeninimas

• Pirimidininiai nukleozidai F, Cl ir Br prisijungia bevandenėje terpėje, I prisijungia sunkiau;

• Vykdant reakcijas vandenyje, susidaro tarpinis 5-Hal, 6-hidroksi pirimidinas, kurį lengva dehidratuoti kaitinant ar naudojant rūgštinį katalizatorių iki 5-Hal-uridino arba 5-Hal-citidino

Pirimidinų brominimas

vyksta keliais etapais ir tam tikromis sąlygomis nukleobazė gali prisijungti du bromus ir hidroksigrupę

Palengvintas pirimidinų halogeninimas

Azido jonas veikia kaip pagalbinis aktyvatorius, padedantis pirimidinui prisijungti halogeną ten, kur įprastai sunku, tai leidžia gauti selektyvų 5-halogeninimą. Halogenas ateina netiesiogiai iš NBS (N-bromosukcinimidinas) ir SMBI (Na-monobromizaocianuratas)

Purinų halogeninimas

• Purininiai nukleozidai lengvai halogeninami vandeniniuose tirpaluose ir organiniuose tirpikliuose;

• G lengviau halogeninamas nei A;

• 8-halogenpurinai - gana nestabilūs, lengvai hidrolizuojantys reakcijos metu, suyra imidazolo žiedas;

• Hal purino C8 padėtyje galima pakeisti kitais pakaitais.

Nitrinimas

• aukšta temperatūra;

• sacharido hidroksigrupės turi būti apsaugotos nuo oksidacijos;

• atitinkamus 5-aminonukleozidus galima gauti redukuojant 5-nitro darinius.

Alkilinimas: metilinimas

• kaitinant uridiną kartu su formaldehidu, esant HCl, vyksta jo 5-hidroksimetilinimas;

• pan. sąl. citidinas nereaguoja;

• 5-hidroksimetilo dariniai gali būti verčiami atitinkamais 5-metilnukleozidais hidrinant per Pt ar Rh katalizatorius.

Nukleozidų reakcijos su aldehidais

• Rūgštinėse sąlygose

• Šarminės reakcija vyksta grįžtamai, gali susidaryti imino junginių mišinys.

• Aldehidas » aldehido aktyvinimas (oksidacija) » redukcija » prie guanino gaunama nauja šoninė grandinė (alkilas). Guaninas tampa modifikuotas, galima keisti jo savybes, tirpumą, reaktyvumą, panaudojimą srityse.

Azoto metilinimas

• su diazometanu labai priklauso nuo sąlygų:

  • guanozinas eteryje » N1-metilguanozinas;

  • guanozinas vandens-eterio terpėje » N7-metilguanozinas;

  • citozinas tik vandeny » N3 pakaitai;

• Nukleozidų polinkis sąveikauti su diazometanu vandens-eterio tirpaluose sumažėja taip: guanozinas ≈ uridinas > citidinas > adenozinas

Metilinimo reagentai

• Bazių metilinimui - CH3I, dimetilsulfatas;

• Neutralioje terpėje G, A, C metilinami, U ir T ne;

• G alkilinamas gaunant N7-metilguanoziną, esant K2CO3 pagrindinis produktas N1-metilguanozinas;

• A metilinimas vyksta daugiausiai N1, o C N3

Izotopiniai vandenilio atomų mainai

• Sparčiausiai keičiami H prijungti su N, su C - daug lėčiau, izotopo keitimas į H vyksta greitai;

• Purino bazėse imidazolo žiedo C8 H keičiasi lengviau nei kiti, o mainų greitis didėja didėjant pH ir temperatūrai;

• Tokie paženklinti nukleozidai naudojami atliekant biologinius eksperimentus

Acilinimas

• Labai priklauso nuo sąlygų;

• Švelnios sąlygos - tik NH2-

• Intensyvios (acilinimo reagento perteklius, aukšta temp.) acilinimas apima ne tik heterociklinį aminą, bet ir azotą.

• Esant dideliam anhidrido pertekliui, acilinasi ir ribozės hidroksigrupės

Hidroksigrupių acilinimas

• Yra acilinimo reakcijų, kad acilintųsi tik ribozės hidroksigrupės;

• Reikia acto rūgšties anhidrido pertekliaus, įprastai acilinasi visos (5’,3’,2’) pentozės hidroksigrupės, tačiau ekvimoliarinį kiekį anhidrido tik 5’

Nukleotidų acilinimas

• Susidaro anhidridas su fosfato grupe, kuris lengvai hidrolizuojasi;

• Uridino 3' -fosfato acilinimo produktas yra 5' -acetiluridino 2',3' -ciklinis fosfatas, o 2',5' -diacetilo darinio išeiga yra labai maža. Pridedant į reakcijos mišinį nukleofilą reaktingesnį nei hidroksi grupė, leidžia geros išeigos acetilintą produktą.

Deacilinimas

• Amido jungtis lengvai nutrūksta esant NH3, tačiau išlieka stabilus šarminėje terpėje (pH>12);

• Sacharidų esterinius ryšius lengvai suardo tiek šarmai, tiek NH3;

• Acto rūgšties darinių atveju amido jungties stabilumas mažėja: guanozinas > adenozinas > citidinas. N4 -acilintuose citidino 5’ -fosfatuose amido stabilumas mažėja kintant acilo grupei: benzoil -> acetil -.

Hidrinimas

• Dviguba jungtis pirimidino nukleoziduose lengvai hidrinama, gaunami 5,6-dihidrodariniai, esant Rh ant aliuminio oksido, taip pat Pt, Pd;

• Kai hidrinamas citidinas, gali vykti ne tik dvigubo ryšio redukcija, kad susidarytų 5,6-dihidrocitidinas, procesas turi būti atidžiai kontroliuojamas;

• Pirimidino nukleozidus galima redukuoti ir naudojant natrio skystą amoniaką arba natrio amalgamą vandenyje, tačiau tokiais atvejais susidaro produktų mišinys;

• Purino nukleozidai atsparūs reduktorių poveikiui.

Reakcijos su HNO₂

• Aminogrupę turintys nukleozidai reaguoja su HNO₂;

• Susidaro diazonio druska, kurioje nevyksta teigiamo krūvio delokalizacija ir kuri lengvai disocijuojasi vandeninėje terpėje, sudarydama hidroksidarinį;

• Deaminuojant G, A, C gaunamas atitinkamas ksantozinas, inozinas ir uridinas.

Glikozidinio ryšio sudarymo ypatumai

• Problemos: bazių regioselektyvumas, anomerų santykis;

• Naudojant EDG, pvz. acetil, dominuos beta anomeras, tačiau tas neveikia su deoksiriboze;

• Norint gauti afla anomerus, reikia naudoti nukreipiančias papildomas reakcijas.

Metalų druskų prijungimas

Fischer-Helferich metodas

• Pentozė acetilinta;

• Purino žiedas turi prijungtą Cl;

• Modifikuota nukleobazė

• Naudojama sidabro druska, palengvinanti glikozidinio ryšio susidarymą;

• Modifikuota nukleobazė keičiama į A arba G

• HgCl₂ didina išeigą;

• Na druskos - gera išeiga, problemos su regioselektyvumu.

Fusion synthesis (lydalo) nukleofilinė reakcija

• aukštoje temp. išlydomas blokuotas angliavandenis, nukleobazė ir Lewis rūgštis su žemu vakuumu;

• Vidutinė išeiga;

• Naudojama dirbtinių bazių prijungimui;

• Antivirusiniai vaistai?

Hilbert-Johnson (tirpalo)

• Lewis rūgštis, aukštesnė temp. - atšiaurios sąlygos;

• Blogas beta selektyvumas ir regioselektyvumas

Vorbruggen arba silyl-Hilbert-Johnson procedūra

• švelnios sąlygos: kambario temperatūra, Lewis rūgštis, sililo apsauga;

• Aukšta išeiga;

• puikus beta-selektyvumas

• idealus pramoninis metodas

Su purinais yra problemų

Vieno puodo reakcija

TFA, TMSCl ir HMDS derinys sukuria trimetilsililtrifluoracetatą in situ, sąlygojantį:

• Nukleobazės sililinimą;

• Sujungimą su cukrumi.

• Viskas vyksta viename reakcijos inde;

• Tai taupo laiką, mažina tarpinių produktų izoliavimo poreikį ir padidina išeigą.

Bazės formavimo reakcijos naudojamos

• kai reikia neįprastų bazių: izobazių, karbociklinių bazių;

• purinų atveju gauti N-7 bazę

Transglikozilinimas

Cukraus perkėlimas nuo vienos bazės prie kitos

• dažniausiai naudojamas įvesti modifikuotus cukrus;

• gali būti cheminis/fermentinis;

• išeiga priklauso nuo nukleobazių termodinaminės pusiausvyros

Deoksiribonukleozidų sintezė

• Iš deoksiribozės gauti elektrofilai nesudaro palankaus katijono, todėl stereoselektyvi sintezė sunkesnė;

• Vienas būdas: ribonukleozido sintezė, po to 3’, 5’ hidroksigrupių apsauga, 2’ hidroksigrupės pašalinimas per Bartono deoksigenaciją ir blokuočių pašalinimas

Nukleotidų sintezė

• Cheminė - nukleozidų fosforilinimas;

• Prijungimas vyksta per hidroksigrupes, taigi, norint prijungti fosfatą prie reikalingos hidroksigrupės, kitas reikia blokuoti;

• Paprastai pentozės hidroksigrupės alkilinamos arba acetilinamos.

Nukleotidų sintezės trūkumai

• Fosforilinimo reagento P atomas turi turėti dalinį teigiamą krūvį, kad vyktų fosforilinimo reakcija. Nei fosforo rūgštis, nei pirofosfatas netinka, kaip reagentai;

• Dėl to fosfato molekulėje įvedami pakaitai, atitraukiantys elektronus ir padidinantys P elektrofiliškumą;

• Naudojami fosforo rūgšties halogenanhidridai, anhidridai, P(III) junginiai;

• Fosforilinimui galima naudoti fermentus: reakcija vyksta specifiškai konkrečiai pozicijai, kitoms nukleozidų hidroksigrupėms blokuočių nereikia.

Fosforilinimas halogenanhidridais

• Naudojamas fosforo oksichloridas POCl₃

• Gautas tarpinis reakcijos produktas hidrolizuojamas, keičiant Cl, išsiskiria HCl, tad reakcijos terpė yra šarminama ir pridedama naftaleno, kad išvengtų glikozinio ryšio hidrolizės. Būtinas pentozės hidroksigrupių blokavimas;

• Yra patobulintas būdas, kuriam nereikia blokuočių, naudojama trimetil arba trietil fosfato.

Trialkil fosfato įtaka nukleotidų sintezei

Pridėjus trimetil ar trietil fosfatų, susidaro nukleozido kompleksas, kurio 5’ hidroksigrupė tampa labiau nukleofiliška.

Propil ir didesnės grupės trukdo šio komplekso susidarymui.

Fosforilinimas per fosforamidatų tarpininką

• Naudojama sintetinant ribonukleotidus;

• Apsauginės grupės pašalinamos su Cu-Zn in situ. Vėlesnė rūgštinė hidrolizė duoda 65-70% išeigos.

Nukleotido sintezė per fosfodiesterio tarpinį produktą

• Dėl prastų fosfoesterių elektrofilinių savybių reikia naudoti jungimo reagentus DCC arba TPS-TAZ;

• Būtinos blokuotės visam nukleozidui

Nukleotido sintezė per cycloSal tarpinį produktą

• Naudojami modifikuoti salicilo rūgšties esteris/anhidridas.

• Fosforo junginiai gali būti V ar III valentingumo.

• Susidaręs junginys hidrolizuojamas šarminėmis sąlygomis.

Nukleotido sintezė per 5’-H-fosfonato tarpinį produktą

Alternatyvus monofosforilinimo metodas rūgštims jautriems nukleozidams

Polifosfatų sintezė

• Naudojami įvairūs tarpiniai aktyvūs produktai, pvz. fosforo oksichlorido dariniai;

• Nebūtinos blokuotės, susidaręs tarpinis junginys turi būti hidrolizuojamas šarminėmis sąlygomis;

• Vietoj pirofosfato, naudojant fosfatą galima gauti difosfatus.

cycloSal tarpinis junginio naudojimas polifosfatų sintezėje

• Būtinos blokuotės;

• Tarpinis junginys turi būti oksiduotas ir hidrolizuojamas šarminėmis sąlygomis;

• Vietoj pirofosfato, naudojant fosfatą galima gauti difosfatus.

Fosfato grupės aktyvavimas

• Jei nėra aktyvaus tarpinio produkto, galima jį pasigaminti naudojant aktyvuojančius reagentus;

• Blokuotės reikalingos ir bazėms.

Tiesioginis polifosfatų prijungimas prie nukleozidų

• Reikia prie 5’ grupės prijungti gerai nueinančią grupę;

• Dažniausiai naudojama toluensulfonilo grupė;

• Išeiga - patenkinama.

Fermentinė sintezė

• Kinazės - katalizuoja fosforilinimą;

• Dažniausiai fosfato grupės donoru naudoja ATP, rečiau kitus nukelozidtrifosfatus ar kitus donorus;

• Kinazės fosforilina tik 5’ hidroksigrupes, kitoms blokuočių nereikia;

• Tačiau, kai kurios, pvz. E. coli kinazės fosforilina 3’ hidroksigrupes, o bakterijos Serratia marcescens - 5’ ir 3’ hidroksigrupes ribo ir deoksiribonukleotiduose.

Jungtinė nukleotidų sintezė

Paprastai vyksta reakcijos su dirbtinėmis ir stipriai modifikuotomis bazėmis.

Nukleozidų ciklofosfatai

• Cheminis fosforilinimas be blokuočių, skiedžiant KOH, žema išeiga;

• H-fosfanato aktyvavimas pivaloilchloridu, būtinos blokuotės.