Okruhy

1. Centrální dogma molekulární biologie

Centrální dogma popisuje tok genetické informace v buňce: DNA se replikuje, přepisuje se do RNA procesem transkripce a RNA je následně přeložena do proteinu při translaci. Základní směr je DNA → RNA → protein, ale existují výjimky, například reverzní transkripce (RNA → DNA) u retrovirů nebo RNA → RNA přepis u některých virů. Informace je v DNA zapsána v sekvenci nukleotidů a čtena pomocí genetického kódu, kde triplety nukleotidů odpovídají jednotlivým aminokyselinám.

2. Primární a sekundární struktura DNA

Primární struktura DNA je dána pořadím nukleotidů (sekvencí bází A, T, G, C). Nukleotid se skládá z deoxyribózy, dusíkaté báze navázané N-glykosidickou vazbou na C1′ a fosfátu na C5′; jednotlivé nukleotidy jsou spojeny fosfodiesterovou vazbou mezi C3′ a C5′. Sekundární strukturu tvoří dvoušroubovice složená ze dvou antiparalelních vláken, kde se báze párují komplementárně (A–T, C–G). Stabilitu DNA zajišťují vodíkové vazby mezi bázemi a stackingové interakce. Rozlišujeme formy A-, B- a Z-DNA, přičemž B-DNA je fyziologicky nejběžnější.

3. Primární a sekundární struktura RNA, typy RNA

RNA je polymer ribonukleotidů, jejichž primární struktura je dána sekvencí bází A, U, G, C. Obsahuje ribózu místo deoxyribózy a uracil místo thyminu. RNA je většinou jednovláknová, ale vytváří sekundární struktury vnitřním párováním bází (smyčky, vlásenky). Základní typy RNA jsou mRNA (přenáší informaci pro syntézu proteinů), tRNA (přenáší aminokyseliny a obsahuje antikodon) a rRNA (strukturální a katalytická složka ribozomů). U eukaryot mRNA vzniká posttranskripčními úpravami primárního transkriptu.

4. Replikace DNA – mechanismus, Okazakiho fragmenty

Replikace DNA je semikonzervativní proces, při němž vznikají dvě molekuly DNA, každá s jedním původním a jedním novým vláknem. DNA polymeráza syntetizuje nový řetězec pouze ve směru 5′→3′ a vyžaduje RNA primer vytvořený primázou. Na vedoucím vlákně probíhá syntéza kontinuálně, zatímco na opožďujícím se vlákně diskontinuálně ve formě Okazakiho fragmentů. RNA primery jsou následně odstraněny, mezery dosyntetizovány DNA polymerázou a fragmenty spojeny DNA ligázou.

5. Transkripce a translace nukleových kyselin a jejich regulace

Transkripce je přepis genetické informace z DNA do RNA pomocí RNA polymerázy, přičemž jako templát slouží nekódující vlákno DNA. U eukaryot probíhá v jádře a primární transkript je dále upravován (capping, polyadenylace, splicing). Translací se informace z mRNA překládá do sekvence aminokyselin v proteinu na ribozomech v cytoplazmě. Aminokyseliny jsou nejprve aktivovány vazbou na tRNA a následně spojovány peptidickými vazbami. Regulace exprese genů probíhá na úrovni transkripce, stability RNA i translace; u prokaryot je typickým příkladem regulace operonový systém.

6. Metody sekvenování DNA

Sekvenování DNA = stanovení pořadí nukleotidů v DNA.
Restrikční endonukleázy DNA nečtou, ale štěpí ji ve specifických (často palindromických) sekvencích; slouží k fragmentaci, mapování a přípravě DNA.
Sangerova metoda je založena na syntéze DNA polymerázou a ukončení řetězce pomocí dideoxynukleotidů (ddNTP) bez 3′–OH.
Pyrosekvenování detekuje uvolnění pyrofosfátu (PPi) při zabudování nukleotidu pomocí světelného signálu.
Sekvenování nové generace (Illumina) umožňuje paralelní fluorescenční čtení milionů fragmentů DNA a je dnes standardem.

7. PCR a PCR v reálném čase – principy a využití

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je metoda in vitro amplifikace specifického úseku DNA, při níž dochází k exponenciálnímu zmnožení cílové sekvence pomocí cyklického střídání teplot. Základními kroky PCR jsou denaturace dvoušroubovice DNA, nasednutí primerů (hybridizace) a elongace nových řetězců pomocí termostabilní DNA polymerázy (např. Taq polymerázy), přičemž syntéza probíhá vždy ve směru 5′→3′. PCR vyžaduje templátovou DNA, primery, dNTP a polymerázu. Varianta real-time PCR (rtPCR) umožňuje sledovat průběh amplifikace v reálném čase pomocí fluorescenčního signálu a kvantifikovat množství DNA nebo genové exprese pomocí Ct hodnoty.

8. Genetické inženýrství, produkce rekombinantních proteinů

Genetické inženýrství je soubor metod umožňujících cílenou manipulaci s genetickým materiálem a tvorbu rekombinantní DNA. Základním principem je izolace genu zájmu, jeho případná amplifikace, štěpení DNA restrikčními endonukleázami a vložení do vhodného vektoru, nejčastěji plazmidu. Rekombinantní DNA je následně přenesena do hostitelské buňky, kde dochází k její replikaci a případně expresi rekombinantního proteinu. Tyto postupy se využívají v biotechnologiích, medicíně a výzkumu, například k produkci terapeutických proteinů nebo studiu funkce genů.