L4: Mikroskopi i Cellebiologi

Hvad definerer et mikroskops opløsning (resolution)?

Den mindste fysiske afstand mellem to punkter, hvor de stadig kan skelnes som to separate punkter (fremfor at flyde sammen)

Hvad er funktionen af henholdsvis Kondensoren, Objektivet og Okularet i et lysmikroskop?

Kondensor: Samler og koncentrerer lyset i et snævert bundt mod prøven.

Objektiv: Den primære samlelinse (første forstørrelse).

Okular: Sekundært linsesystem ved øjet (yderligere forstørrelse

Hvorfor opfandt man Fasekontrastmikroskopi?

For at kunne se ufarvede, levende celler. Det omsætter usynlige forskydninger i lysets "fase" (skabt når lyset bremses i forskellige celledele) til synlige ændringer i lysets "amplitude" (mørk/lys kontrast).

Hvordan fungerer mærkning med GFP (Green Fluorescent Protein)?

Man kobler genet for GFP fast på genet for et interesseprotein. Cellen danner så et fusionsprotein, hvor fluoroforen sidder som en fastgjort "lampe", så man kan følge molekylets færden.

Forklar "Stokes Shift" (Jablonski-diagrammet).

Når en elektron exciteres af laserlys, absorberer den energi. Før den returnerer til grundtilstanden (S0​) og udsender fluorescens, tabes der lidt energi som varme (vibration). Derfor har det udsendte lys lavere energi og dermed længerebølgelængde end excitationslyset. Forskellen kaldes Stokes Shift.

Hvad er "Quantum Yield"?

Forholdet mellem udsendte fotoner (emission) og absorberede fotoner. Et højt quantum yield giver et mere lysende molekyle og reducerer fotoblegning/toksicitet.

Hvilke 3 komponenter udgør et "Filter Cube" i et fluorescensmikroskop?

1) Excitationsfilter (lader rette indgående lys passere).

2) Dikroisk spejl (sender excitationslys ned mod prøven, lader emissionslys passere op).

3) Emissionsfilter (frasorterer støj, fanger Stokes-shifted returlys).

Hvad er Numerisk Apertur (NA) et mål for, og hvad sker der, når den stiger

NA beskriver et objektivs evne til at indsamle spredte fotoner. Jo højere NA, desto bedre opløsning.

Hvorfor bruger man immersionsolie mellem objektiv og dækglas ved store forstørrelser?

For at forhindre at lyset brydes voldsomt og går tabt (spredes). Olien har samme brydningsindeks som glasset (ca. 1.51 i stedet for luftens 1.0), hvilket øger objektivets Numeriske Apertur (NA).

Hvad er tommelfingerreglen for den teoretiske diffraktionsgrænse (opløsning) i et konventionelt lysmikroskop?

Ca. 200 nm (strukturer tættere på hinanden end dette vil flyde sammen til én sløret klat pga. bølgernes overlap).

Hvad er den største ulempe ved "Widefield" fluorescensmikroskopi på tykke prøver?

Alt lyses op på én gang, så fluoroforer ude af fokus (over/under fokalplanet) sender et kraftigt, sløret baggrundslys ind i billedet.

Hvordan løser Konfokalmikroskopet (CLSM) problemet med baggrundsslør?

Det bruger en laser, der skanner punkt for punkt, kombineret med et fysisk Pinhole (et lille hul) foran detektoren. Hullet frasorterer alt sløret lys ude af fokus, hvilket skaber ultraskarpe optiske snit

Hvad er et Spinning Disk (SD) konfokalmikroskop?

En variation, hvor laseren spredes over en hurtigt roterende skive med hundredevis af pinholes. Det tillader multi-point skanning, hvilket markant øger hastigheden og skåner levende celler.

Hvad er den generelle fordel ved EM og forskellen på TEM og SEM?

Fordel: Elektroner har en ekstremt lille bølgelængde, hvilket bryder diffraktionsgrænsen massivt.

TEM: Elektroner skydes igennem prøven for at se indre nanostrukturer.

SEM: Elektroner skannes over overfladen, hvilket skaber dybe 3D-billeder af overfladetopologier.

Hvad er den helt store fordel ved Super-Resolution (Nanoscopy) ift. EM?

Man opnår ekstrem høj opløsning (helt ned til 10 nm) uden at forlade lysmikroskopien, hvilket gør det muligt at bruge fluorescerende markører på specifikke proteiner og potentielt se levende celler.

Hvordan presser STED mikroskopi opløsningen optisk?

STED (Stimulated Emission Depletion) bruger en excitationslaser kombineret med en donut-formet "Depletion-laser", der tvinger alle fluoroforer i de ydre ringe af punktet til at slukke. Dermed er det kun plettens "zero point" (det inderste), der lyser, hvilket reducerer punktets størrelse markant.

Hvordan presser PALM mikroskopi opløsningen via tid?

PALM tænder kun enkelte, meget adskilte fluoroforer ad gangen i et billede. Computeren beregner lysets centrum og slukker dem igen. Dette gentages tusindvis af gange over tid, hvorefter computeren sætter alle prikkerne (som pointillisme) sammen til ét ekstremt skarpt billede

Hvad bruges FRET (Förster Resonance Energy Transfer) til, og hvad er et krav for, at det virker?

Brug: Til at bekræfte fysiske protein-protein interaktioner eller konformationsændringer i levende celler.

Krav: Donoren og Acceptoren skal være utroligt tæt på hinanden (max 10 nm), for at resonans-energien kan overføres direkte, og Donorens emissionsspektrum skal overlappe Acceptorens absorption.

Hvordan fungerer BIFC (Bimolecular Fluorescence Complementation)?

En fluorofor klippes over i to halve domæner (sat på hhv. Protein A og B). Hvis Protein A og B danner en fysiologisk interaktion, tvinges de to

fluorofor-dele sammen og genetablerer strukturen og fluorescenssignalet.

Hvad er det overordnede "trade-off" (afvejning), man altid skal forholde sig til i valg af mikroskop?

Man skal altid optimere mellem modstridende parametre: Opløsning vs. Kontrast vs. Hastighed vs. Toksicitet (blegning/celledød) vs. Dybdepenetrering.

Hvilket mikroskop skal du bruge til at tælle blodceller?

Lysmikroskopi

Hvilket mikroskop er bedst til overordnet at følge væksten af levende celler?

Lysmikroskopi

Hvilket mikroskop skal du vælge for at se detaljeret på strukturen af porer inde i nucleus (cellekernen)?

Transmission elektron mikroskopi (TEM) (Ser igennem ultratynde snit)

Hvilket mikroskop bruges til at studere den 3-dimensionale overflade af en mide?

Skanning elektron mikroskopi (SEM) (Skanner overfladetopologien)

Hvilket mikroskop er bedst egnet til at følge lokaliseringen af et protein over tid (live-cell imaging)?

Wide field fluorescence (Hurtigt og mere skånsomt for levende celler over tid)

Hvilke to mikroskopityper er særligt gode til at visualisere dannelsen af tynde aktin-fibre i en celle?

Konfokalmikroskopi og Superopløsning (Fjerner baggrundsslør og giver ekstrem høj opløsning)

Hvilket mikroskop skal du primært bruge til at se på interaktionen mellem proteiner dybere inde i levende væv?

Konfokalmikroskopi (Tillader optisk snitning i tykke prøver)

Hvilket mikoskop skal jeg vælge ?