PCR - kolosik

Składniki PCR

• Matrycowe DNA

• Startery ( primery )

• dNTP

• Polimeraza DNA (np. Taq )

• MgCl2

• Bufor reakcyjny

Skład dNTP:

• zasada azotowa (A,T,G,C )

• cukier ( deoksyryboza )

• 3 grupy fosforanowe

Cechy dNTP

• A + T

• G + C

• termolabilne

• zbyt dużo dNTP = błędy

• zbyt mało dNTP = słaba amplifikacja

3 fazy PCR

1. Faza logarytmiczna

2. Faza liniowa

3. Faza plateau

1. Faza logarytmiczna

• DNA mnoży się bardzo szybko, podwaja w każdej rundzie

• to najlepszy moment na analizę

2. faza liniowa

• reakcja zaczyna zwalniać

• DNA nadal się kopiuje, ale nie tak szybko

• Dzieje się tak, bo zaczyna brakować składników ( np. enzymów, dNTP, Mg2+) albo enzym się zużywa

3. Faza plateau

• reakcja prawie staje

• DNA już się nie kopiuje albo tylko minimalnie

faza logarytmiczna

faza liniowa

faza plateau

Długość starterów

18-25 nukleotydów

Co to startery?

• krótkie fragmenty DNA ( oligonukleotydy )

• przyczepiają się do konkretnego miejsca na matrycy DNA

• wyznaczają początek syntezy nowej nici DNA przez polimerazę

zawartość GC w starterze

40-60% ( zapewnia stabilne wiązania )

Startery - brak struktur drugorzędowych

nie mogą się “zaginać” w pętle ( hairpiny ) lub łączyć ze sobą )

Temperatura topnienia starteru

50-65 stopni

Denaturacja

DNA się rozdziela

Annealing

startery się przyczepiają do matrycy

Elongacja

polimeraza DNA buduje nowe nici od miejsca przyczepienia startera

Rodzaje starterów

• Forward primer ( do przodu, przyczepia się do nici 3’ → 5’ )

• Reverse primer ( od tyłu, przyczepia się do nici 5’ → 3’ )

• Random primers ( losowe sekwencje, do odwrotnej transkrypchi RNA )