Tiere

Warum ist die Erzeugung transgener Tiere schwieriger als die Erzeugung transgener Pflanzen?

Pflanzenzellen sind totipotent und können zu vollständigen Pflanzen regeneriert werden. Bei Tieren ist dies nicht möglich. Daher muss die genetische Veränderung bereits in embryonalen Stammzellen oder sehr frühen Embryonalstadien erfolgen, damit sie in alle Zellen einschließlich der Keimbahn gelangt.

Was sind embryonale Stammzellen (ES-Zellen)?

ES-Zellen stammen aus der inneren Zellmasse der Blastozyste. Sie sind pluripotent, können sich langfristig in Kultur vermehren und sich zu nahezu allen Zelltypen des Körpers entwickeln.

Welche drei Hauptschritte umfasst die klassische Erzeugung einer Knockout-Maus?

1. Genetische Veränderung von ES-Zellen durch homologe Rekombination. 2. Übertragung der rekombinierten ES-Zellen in eine Blastozyste. 3. Kreuzung der entstehenden chimären Mäuse, um Tiere mit Keimbahnübertragung der Mutation zu erhalten.

Warum werden ES-Zellen auf Feeder-Zellen kultiviert?

Feeder-Zellen verhindern die spontane Differenzierung der ES-Zellen und erhalten deren pluripotenten Zustand.

Warum ist homologe Rekombination bei ES-Zellen schwer nachzuweisen?

Nicht-homologe Rekombination tritt 1.000- bis 10.000-mal häufiger auf als homologe Rekombination. Deshalb sind geeignete Selektionsverfahren erforderlich, um die wenigen korrekt rekombinierten ES-Zellen zu identifizieren.

Welche Funktion besitzt das neoR-Gen im Knockout-Konstrukt?

Das neoR-Gen vermittelt Resistenz gegen Neomycin (bzw. G418) und dient der Positivselektion. Nur Zellen, die das neoR-Gen aufgenommen haben, überleben die Behandlung mit Neomycin.

Welche Funktion besitzt das TKHSV-Gen?

Das Thymidinkinase-Gen des Herpes-simplex-Virus (TKHSV) dient der Negativselektion. Zellen, die dieses Gen enthalten, werden durch Ganciclovir abgetötet.

Warum werden sowohl Positiv- als auch Negativselektion eingesetzt?

Positivselektion: identifiziert alle Zellen, die das DNA-Konstrukt aufgenommen haben. Negativselektion: entfernt diejenigen Zellen, bei denen das Konstrukt zufällig (nicht-homolog) in das Mausgenom integriert wurde. Dadurch bleiben überwiegend Zellen mit homologer Rekombination übrig.

Warum sind homolog rekombinierte ES-Zellen gegen Ganciclovir resistent?

Bei der homologen Rekombination wird nur der zwischen den homologen Armen liegende Abschnitt (einschließlich neoR) eingebaut. Das außerhalb der Homologiearme liegende TKHSV-Gen wird nicht in das Mausgenom integriert. Deshalb fehlt die Empfindlichkeit gegenüber Ganciclovir.

Wie kann nachgewiesen werden, ob eine Maus heterozygot oder homozygot für die Mutation ist?

Durch PCR mit geeigneten Primern und anschließende Gelelektrophorese. Je nach Genotyp entstehen unterschiedlich große PCR-Produkte oder unterschiedliche Bandenmuster.

Warum kann ein vollständiger Knockout eines Gens problematisch sein?

Ist das Gen für lebenswichtige Funktionen erforderlich, kann sein vollständiger Verlust embryonal letal sein oder schwere Entwicklungsstörungen verursachen.

Was ist das Cre-LoxP-System?

Das Cre-LoxP-System ist ein Rekombinationssystem aus dem Phagen P1. Die Cre-Rekombinase erkennt LoxP-Sequenzen und entfernt die dazwischen liegende DNA.

Wie funktioniert ein konditionaler Knockout mithilfe des Cre-LoxP-Systems?

Das Zielgen wird von zwei LoxP-Sequenzen flankiert („gefloxt“). Cre wird unter einem gewebespezifischen oder induzierbaren Promotor exprimiert. Nur in den Zellen, in denen Cre aktiv ist, wird das Zielgen entfernt.

Warum werden die LoxP-Sequenzen meist in Introns oder beidseits eines Exons eingefügt?

Dadurch wird die normale Genfunktion zunächst nicht beeinträchtigt. Die LoxP-Sequenz im Intron wird im Zuge des Spleißens aus der prä-mRNA entfernt; die reife mRNA wird zum Wildtyp-Protein translatiert, welches seine normale Funktion ausführt. Erst nach Expression der Cre-Rekombinase wird das flankierte Exon entfernt und damit das Gen inaktiviert.

Welche Vorteile besitzt die CRISPR/Cas-Methode gegenüber der klassischen Herstellung von Knockout-Mäusen?

Keine ES-Zellen erforderlich; direkte Injektion von Cas9 und gRNA in Zygoten; deutlich schneller (Wochen statt etwa ein Jahr); gleichzeitiger Knockout mehrerer Gene möglich; auch zell- oder organspezifische Anwendungen möglich.

Warum müssen chimäre Mäuse, die sich nach der Übertragung rekombinierter ES-Zellen in eine Blastocyste entwickeln, noch gekreuzt werden?

Die übertragenen ES-Zellen tragen zunächst nur zu einem Teil der Gewebe der Maus bei. Erst wenn sie auch zur Entwicklung von Keimzellen führen, kann die Mutation an die Nachkommen weitergegeben werden (Keimbahn). Durch Kreuzungen lassen sich schließlich heterozygote und anschließend homozygote Knockout-Tiere erzeugen.

Warum eignet sich das Cre-LoxP-System besonders für die Untersuchung essenzieller Gene?

Essenzielle Gene können damit gezielt in bestimmten Zelltypen oder Entwicklungsstadien ausgeschaltet werden. Dadurch bleibt das Tier lebensfähig, während die Funktion des Gens in einem definierten Gewebe untersucht werden kann.

Vergleichen Sie die klassische Herstellung einer Knockout-Maus mit der CRISPR/Cas9-Methode.

Klassische Methode: Veränderung von ES-Zellen, homologe Rekombination erforderlich, Positive/Negativselektion notwendig, zeitaufwändig (≈ 1 Jahr), meist ein Gen. CRISPR/Cas9: direkte Editierung der Zygote, DNA-Schnitt durch Cas9 und Reparaturmechanismen, meist keine ES-Zell-Selektion erforderlich, wenige Wochen, mehrere Gene gleichzeitig editierbar.

Warum ist die Keimbahnübertragung bei transgenen Tieren entscheidend?

Nur genetische Veränderungen, die in den Keimzellen vorhanden sind, können an die nächste Generation weitergegeben werden. Eine Mutation ausschließlich in somatischen Zellen ist nicht vererbbar.

Welche Funktion besitzt das TKHSV-Gen bei der Herstellung von Knockout-Mäusen mittels Positiv-Negativ-Selektion?

Das TKHSV-Gen dient der Negativselektion. Bei zufälliger nicht-homologer Integration wird TKHSV mit eingebaut. Diese Zellen werden durch Ganciclovir abgetötet, da TKHSV Ganciclovir in ein toxisches Produkt umwandelt. Bei homologer Rekombination wird TKHSV nicht integriert und die Zellen überleben.

Beschreiben Sie ausführlich das Verfahren zur Herstellung von Knockout-Mäusen mittels der Positiv-Negativ-Selektion.

Eine DNA-Konstrukt mit Homologiearmen, neoR-Gen und TKHSV-Gen wird in embryonale Stammzellen eingebracht. Bei homologer Rekombination wird der Zielbereich der Maus-DNA durch das Konstrukt ersetzt. Dabei wird neoR integriert, TKHSV jedoch nicht. Die Zellen überleben dadurch die Positivselektion mit Neomycin/G418 und die Negativselektion mit Ganciclovir. Bei nicht-homologer Rekombination wird das gesamte Konstrukt inklusive TKHSV zufällig eingebaut. Diese Zellen überleben die Positivselektion, sterben aber durch Ganciclovir. Die korrekt rekombinierten ES-Zellen werden anschließend in Blastozysten übertragen, wodurch chimäre Mäuse entstehen. Durch Kreuzung wird die Mutation über die Keimbahn weitergegeben.

Welche Rolle spielen die Antibiotika bei der Positiv-Negativ-Selektion?

Neomycin/G418 selektiert Zellen mit neoR-Gen (Positivselektion). Ganciclovir entfernt Zellen mit TKHSV-Gen (Negativselektion), da diese das Medikament in ein toxisches Produkt umwandeln.