Rekombinante DNA-Technologie

Diese Flashcards decken die wesentlichen Begriffe und Konzepte der rekombinanten DNA-Technologie ab, einschließlich Restriktionsenzymen, PCR, Klonierung und DNA-Sequenzierung.

Rekombinante DNA-Technologie

Eine Technologie, um DNA mit Präzision in einem Reagenzglas oder Organismus zu manipulieren, indem genetisches Material aus verschiedenen Quellen zusammengebracht wird, um neue Sequenzen zu schaffen.

Nukleotid-Bestandteile

Besteht aus drei Teilen: (1) einem Zucker, (2) einer Phosphatgruppe und (3) einer stickstoffhaltigen Base.

Adenin-Thymin-Paarung

Basenpaarung über $2$ Wasserstoffbrückenbindungen.

Cytosin-Guanin-Paarung

Basenpaarung über $3$ Wasserstoffbrückenbindungen.

Restriktionsendonukleasen

Bakterielle Enzyme, die als Verteidigungsmechanismus gegen Fremd-DNA dienen und DNA an spezifischen Erkennungssequenzen schneiden.

Nobelpreis für Physiologie/Medizin 1978

Verliehen an Werner Arber, Hamilton Smith und Daniel Nathans für die Entdeckung der Restriktionsenzyme und deren Anwendung in der Molekulargenetik.

Methylase-Modifizierung

Schutzmechanismus, bei dem bakterielle DNA unmittelbar nach der Replikation methyliert wird, um sie vor den eigenen Restriktionsenzymen zu schützen.

4-base Cutter

Restriktionsenzyme (z. B. AluI), die im Durchschnitt alle $256$ bp ($4^4$) schneiden.

Palindrom (Molekulargenetik)

Eine Nukleotidsequenz, bei der beide Stränge gegenläufig dieselbe Sequenz aufweisen; Erkennungsstelle für Typ-II-Restriktionsenzyme.

Sticky ends

Einzelsträngige Überhänge am Ende von DNA-Fragmenten, die durch versetzte Schnitte einiger Restriktionsenzyme entstehen.

Blunt ends

Stumpfe Enden ohne Überhänge, die entstehen, wenn Restriktionsenzyme beide DNA-Stränge in der Mitte des Palindroms schneiden.

Gelelektrophorese

Methode zur räumlichen Trennung negativ geladener Nukleinsäure-Moleküle in einem elektrischen Feld, wobei das Gel als Molekularsieb wirkt.

Ethidiumbromid (EtBr)

Ein fluoreszierendes Molekül, das sich in DNA/RNA einlagert und unter UV-Licht zur Visualisierung von DNA-Bändern genutzt wird.

Agarose-Gel

Horizontal gegossenes Gel aus Seegras-Polysacchariden, das zur Trennung großer DNA-Fragmente ($100$ bis $30.000$ bp) verwendet wird.

Polyacrylamide-Gel

Vertikal gegossenes, neurotoxisches Gel zur hochauflösenden Trennung sehr kleiner DNA-Fragmente ($6$ bis $2.000$ bp) oder Proteine.

Plasmide

Kleine, zirkuläre DNA-Moleküle in Bakterien, die sich unabhängig von der chromosomalen DNA replizieren und als Klonierungsvektoren dienen.

MCS (Multiple Cloning Site)

Ein DNA-Abschnitt eines Plasmids (auch Polylinker genannt), der eine große Anzahl an Erkennungssequenzen für verschiedene Restriktionsenzyme besitzt.

Antibiotikaresistenzgen (ampR)

Selektionsmarker in Vektoren, der Resistenz gegen ein Antibiotikum verleiht, um das Vorhandensein des Plasmids in der Wirtszelle zu überprüfen.

Alpha-Komplementierung

Grundlage der Blau-weiß-Selektion; die Unterbrechung des lacZ-Gens durch ein Insert führt zur Bildung weißer Kolonien statt blauer.

T4-DNA-Ligase

Aus dem Bakteriophagen T4 isoliertes Enzym, das unter ATP-Verbrauch und Anwesenheit von $Mg^{2+}$ Phosphodiesterbindungen zwischen DNA-Enden knüpft.

Transformation

Übertragung fremder DNA in eine Wirtszelle, oft durch Behandlung mit $CaCl_2$ und Anwendung eines Hitzeschocks ($30$-$60$ s bei $42\,^{\circ}C$).

PCR (Polymerase-Kettenreaktion)

In-vitro-Technik zur millionenfachen Vervielfältigung spezifischer DNA-Abschnitte mittels zyklischer Denaturierung, Annealing und Verlängerung.

Taq-Polymerase

Thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, die in der PCR zur DNA-Synthese bei ca. $72\,^{\circ}C$ eingesetzt wird.

Primer

Kurze Oligonukleotide (ca. $20$ bp), die komplementär zur Zielsequenz sind und als Ausgangspunkte für die DNA-Amplifikation dienen.

Reverse Transkriptase

RNA-abhängige DNA-Polymerase aus Retroviren, die mRNA in komplementäre DNA (cDNA) umschreibt.

Sanger-Sequenzierung

Klassische DNA-Sequenzierungsmethode, die auf dem gezielten Kettenabbruch durch Didesoxynukleotide (ddNTPs) basiert.

ddNTPs (Didesoxynukleotide)

Nukleotid-Analoga, denen an der $3'C \text{-Position}$ die OH-Gruppe fehlt, wodurch die weitere Polymerisation der DNA-Kette gestoppt wird.