03PCR RTPCR

PCR คืออะไร?

PCR (Polymerase Chain Reaction) คือ เทคนิคที่ใช้ในการเพิ่มปริมาณ DNA ในหลอดทดลอง (in vitro) โดยเลียนแบบการสังเคราะห์ DNA ในธรรมชาติ ต้องทราบลำดับ nucleotide ของ DNA ที่จะเพิ่มก่อน ทำให้มีปริมาณ DNA เพิ่มขึ้นเป็นล้านเท่า

องค์ประกอบหลักของ PCR มีอะไรบ้าง?

1. DNA template (หรือ Target DNA): DNA ต้นแบบที่ต้องการเพิ่มปริมาณ สกัดได้จากเซลล์ เนื้อเยื่อ หรือสารน้ำต่างๆ

2. Primers: DNA สายสั้นๆ ยาวประมาณ 20-30 nt มี 2 ชนิดคือ forward และ reverse primer ต้องมีความจำเพาะกับลำดับเบสเป้าหมาย

3. dNTPs (Deoxy Nucleotide Tri-Phosphates): สารตั้งต้นสำหรับสร้าง DNA สายใหม่ มี 4 ชนิดคือ dATP, dTTP, dCTP และ dGTP

4. Thermostable enzyme: เอนไซม์ที่ทนความร้อนได้ เช่น Taq DNA polymerase ซึ่งสกัดจากแบคทีเรีย Thermus aquaticus หรือ Pfu DNA polymerase

5. Mg2+ ion: โคแฟกเตอร์ที่ช่วยการทำงานของเอนไซม์

6. Buffer solution: รักษาสมดุลกรด-เบส และประจุไฟฟ้าของปฏิกิริยา

ขั้นตอนหลักใน PCR cycle มีอะไรบ้าง?

1.Pre-denaturation: ให้ความร้อนที่ 95 °C เพื่อคลาย DNA ก่อนเริ่มรอบ PCR

2.Denaturation: ให้ความร้อนที่ 95 °C เพื่อแยก DNA สองสายออกจากกัน

3.Annealing: ลดอุณหภูมิลง (55-65 °C) เพื่อให้ primer จับกับ DNA template

4.Extension/Elongation: เพิ่มอุณหภูมิ (68-72 °C) เพื่อให้ DNA polymerase สร้าง DNA สายใหม่ต่อจาก primer

5.Post-extension: เป็นขั้นตอนสุดท้ายเพื่อจัดการ DNA ที่สร้างไม่สมบูรณ์

Primer ใน PCR มีคุณสมบัติอย่างไร?

1. มีความยาวประมาณ 20-30 nt

2. มี 2 ชนิดคือ forward และ reverse primer

3. มีความจำเพาะกับลำดับเบสเป้าหมายใน DNA template

4. ไม่มี inverted repeat sequence

5. มี GC content ประมาณ 40-60%

6. มี Tm (Melting Temperature) อยู่ในช่วง 55-65 °C

7. Forward primer จับกับ anti-sense strand (3’->5’) และ reverse primer จับกับ sense strand (5’->3’)

Taq DNA polymerase คืออะไร

เป็นเอนไซม์ที่สกัดจากแบคทีเรีย Thermus aquaticus

Taq DNA polymerase มีคุณสมบัติอย่างไร?

1. ทนความร้อนได้สูงถึง 94-95 °C

2. ทำหน้าที่สร้างสาย DNA โดยเติม dNTPs ในทิศทาง 5’->3’

3. ไม่มีคุณสมบัติ proofreading คือไม่สามารถตรวจสอบและแก้ไขข้อผิดพลาดในการเติม nucleotide ได้

ปัจจัยใดบ้างที่มีผลต่อความสำเร็จของ PCR?

1. ความยาวของ primer: สั้นไปอาจเกิด non-specific binding, ยาวไปอาจจับกับ template ยาก

2. อุณหภูมิของปฏิกิริยา โดยเฉพาะ annealing temperature

3. ความเข้มข้นของ Mg2+ : มากหรือน้อยเกินไปจะทำให้เอนไซม์ไม่ทำงาน

4. pH ของปฏิกิริยา: ควรอยู่ที่ประมาณ 8.5

5. จำนวนรอบของปฏิกิริยา: น้อยไปอาจไม่เห็น product

PCR มีข้อจำกัดอะไรบ้าง?

1. ต้องทราบลำดับ nucleotide บริเวณขอบของ DNA ที่ต้องการเพิ่ม

2. Taq DNA polymerase มีข้อผิดพลาดในการเติม nucleotide

3. ขนาด PCR product ที่เหมาะสมคือ < 1 kb

4. เกิดการปนเปื้อนได้ง่าย

RT-PCR คืออะไร?

(Reverse Transcription PCR) คือ PCR ที่มี RNA เป็น template เริ่มต้น ต้องเปลี่ยน RNA เป็น cDNA ก่อนด้วยเอนไซม์ reverse transcriptase จากนั้นนำ cDNA ไปทำ PCR

PCR และ RT-PCR มีประโยชน์อย่างไรบ้าง?

1. การวินิจฉัยโรคติดเชื้อและโรคทางพันธุกรรม

2. การศึกษาความผันแปรของพันธุกรรม

3. การทำแผนที่ยีน

4. การศึกษาความหลากหลายทางชีวภาพ

5. การตรวจหายีนที่ต้านทานยา

6. การตรวจสอบสายพันธุ์พืช