Tema 3B: Tipos de microscopía óptica

Microscopio óptico invertido

• La fuente de luz está ubicada por encima de la platina y el principio de funcionamiento y formación de la imagen es el mismo que el del microscopio tradicional.

• El revólver y objetivos por debajo de la platina.

• Utilizado principalmente para cultivos celulares (células vivas) sin una preparación previa.

Microscopía de campo claro

• Se usa luz visible.

• La muestra debe ser lo bastante fina como para que los haces de luz puedan atravesarla.

• Se usan métodos de tinción, según las necesidades, con el fin de resaltar los detalles en la imagen (CONTRASTE).

• En general con este microscopio se pueden alcanzar los 1000 aumentos, pudiéndose llegar con ciertas modificaciones a 2000 y 3000 aumentos.

  

Microscopía de campo oscuro

Utiliza una apertura con forma de anillo situada entre la fuente de luz y la lente del condensador. El condensador enfoca la luz que pasa por la abertura en forma de anillo sobre el espécimen biológico o la muestra de material que se va a observar.

Las estructuras del espécimen o las características de la muestra difractan o dispersan porciones de la luz anular. La luz difractada entra en el objetivo.

Permite que sólo aquellos rayos que han sido desviados por la muestra observada sean captados por el objetivo.

Ideal para: organismos acuáticos vivos, diatomeas, insectos pequeños, huesos, fibras, pelo, bacterias sin tinción, levaduras, células en cultivo de tejidos y protozoos.

Diferencias entre campo claro y oscuro

Microscopía de contraste de fase

• Técnica basada en traducir cambios de fase de las ondas de luz que pasan a través de una muestra en cambios de amplitud.

• Sus dos elementos esenciales son: un anillo para inducir un cambio de fase en la luz y un filtro para reducir su intensidad o amplitud.

• Este tipo de microscopía es especialmente útil para observar muestras biológicas vivas.

• Existen dos clases de microscopía por contraste de fases: positiva y negativa. En la positiva el espécimen aparece más oscuro que el resto de la muestra (lo contrario en la negativa).

Microscopía de interferencia / contraste diferencial (DIC)

Emplea filtros polarizantes y prismas para producir imágenes con bastante tridimensionalidad.

Emplea luz polarizada la cual pasa por dos prismas birrefringentes que la fraccionan en dos rayos cuyos trayectos e índices de refracción son diferentes. Se unen e interfieren y forman una imagen del espécimen en 3D o relieves que corresponden a las variaciones de la densidad óptica de la muestra.

Microscopía de luz polarizada

Este microscopio usa luz polarizada (luz que vibra en un solo plano) para iluminar la muestra.

2 tipos de sustancias:

• Isotrópicas: Índice de refracción (n) es igual en todas las direcciones.

• Anisotrópicas: la luz no se transmite a la misma velocidad → n diferente según la dirección. Produce birrefringencia → dos rayos perpendicularmente polarizados.

El contraste de la imagen se observa gracias a la interacción de la luz polarizada con los elementos birrefringentes.

Aplicaciones de este tipo de microscopía:

• Identificar sustancias cristalinas o fibrosas intracelulares y extracelulares.

• Identificar y estimar cuantitativamente componentes minerales (hueso, dientes).

Microscopía de epi-fluorescencia

La fluorescencia es un fenómeno que tiene lugar cuando una sustancia absorbe luz a una determinada longitud de onda y emite luz a otra longitud de onda.

El electrón se excita a un estado de energía mayor (viene con onda corta y muy energética) y produce una onda con mayor longitud y menso energética (otro color)

Ej:

Usos:

• Visualizar determinadas partes de la célula: membrana plasmática, núcleo, vacuolas, retículo endoplásmico, etc.

• Estudiar la interacción entre moléculas in vivo, procesos celulares (división celular, muerte celular…)

• Localizar moléculas específicas: proteínas, lípidos, etc

Microscopía de barrido láser confocal

• Utiliza un láser como fuente de iluminación.

• La imagen se forma por un barrido punto a punto de la muestra

• Elimina luz procedente de los planos fuera del foco (pinhole)

• Permite obtener secciones ópticas confocales.

• Soporte informático

1. El rayo láser (luz verde) es filtrado por un agujero y un espejo dicroico y luego es enfocado mediante un lente objetivo sobre el espécimen y estimula la fluorescencia presente en el mismo. El rayo láser debe ser desplazado por todo el espécimen (escaneo o barrido).

2. La fluorescencia es recolectada por el objetivo y dirigida al espejo dicroico que la refleja y dirige hacia un detector.

3. Un segundo filtro (pinhole) con agujero se coloca frente al detector y sólo deja pasar la luz proveniente del plano de enfoque.

4. La fluorescencia fuera de foco de las zonas que están por encima y por debajo del plano de enfoque no pasa por el agujero y por lo tanto no formará parte de la imagen.

5. Para reconstruir las imágenes a partir de los datos obtenidos, se emplean programas informáticos

Mejoras de la fluorescencia convencional a la confocal:

• Detección de señales fluorescentes poco intensas.

• Eliminación del ruido de fondo.

• Mejoría en el enfoque de la imagen fluorescente.

• Obtención de imágenes de la muestra a diferentes profundidades: estudios 3D

• Obtención de vídeos