Tema 4: técnicas generales de preparación de muestras biológicas para la observación de tejidos y células en microscopio óptico

Fijación

Proceso mediante el cual las muestras biológicas se someten a la acción de sustancias químicas (fijadores) o agentes físicos que conservan las estructura de las mismas, deteniendo los procesos de degradación que tienen lugar en los órganos muertos.

Tipos de fijación

Física:

• Calor: mechero, microondas…

• Frío: criofijación, criosustitución.

Química:

• Agentes entrecruzantes: aldehidos.

• Agentes oxidante.

• Agentes precipitantes: etanol, metanol…

• Otros.

Fijación por perfusión

La solución fijadora se introduce a través de la arteria que irriga el órgano. Fijación rápida y uniforme (bomba peristáltica). Se consigue que la solución fijadora llegue a todas las células a través del sistema sanguíneo.

Tiempo de fijación

Duración óptima variable para diferentes fijadores (entre 2 horas y 2-3 días).

Concentración del fijador

Cada fijador tiene un rango de concentraciones que proporciona buenos resultados.

(Formaldehído: 4% o inferior,Glutaraldehído: 2-5%, Ácido acético 10% o inferior, Etanol: 60-90%, Tetróxido de osmio entre 0,5-2%)

Temperatura de fijación

• 0-4ºC (microscopía electrónica, histoquímica, inmunocitoquímica)

• Temperatura ambiente (técnicas generales de tinción para microscopía óptica)

• Mayores temperaturas (hasta 60ºC) incrementan la velocidad de fijación (biopsias urgentes)

pH durante la fijación

Ajustado al rango fisiológico (entre 6 y 8). pH ácido en casos específicos (5,5 para mucosa gástrica).

Uso de tampones: no deben reaccionar con el fijador ni con componentes del tejido (pueden inhibir enzimas).

Velocidad de difusión/Poder de penetración

Muestras pequeñas o delgadas.

→ Distancia penetrada es proporcional a la raíz cuadrada del tiempo:

  d = K √ t 

K = coeficiente de difusión: distancia en mm que el fijador penetra en el tejido después de 1h de fijación. Es específico para cada fijador.

Osmolaridad de fijación

Inclusión

Proceso mediante el cual las muestras fijadas se infiltran con un material firme que da consistencia y permite seccionar en cortes delgados de espesor homogéneo.

→ Parafina (M.O.) bajo coste y fácil manejo

La mayoría de los medios de inclusión no son hidrosolubles: hay que eliminar el agua y sustituirla por un líquido miscible con nuestro medio de inclusión.

Si una muestra no está completamente embebida en el medio de inclusión se deteriorará y la obtención de secciones homogéneas será imposible.

Parafina

• Mezcla de hidrocarburos.

• No miscible con el agua.

• Fácilmente manipulable y barata.

• Sólida a temperatura ambiente. Punto de fusión entre 40 y 70ºC.

Etapas de la inclusión

1. Deshidratación.

2. Aclaramiento.

3. Infiltración.

4. Confección del bloque.

Deshidratación

Se hace con sustancias hidrófilas que difunden hacia el interior de los tejidos y se intercambian con el agua de los mismos (el agua es extraída). Las concentraciones de los agentes deshidratantes han de ser progresivamente crecientes, para evitar corrientes de difusión que puedan provocar daños en el tejido (retracción).

Aclaramiento

Los agentes deshidratantes no son miscibles con parafina. Por eso se hace un tratamiento intermedio del tejido con disolventes miscibles con agentes deshidratantes (alcohol) y con el medio de inclusión (parafina). Algunos agentes aclarantes son el xileno o el tolueno.

Infiltración

Progresiva sustitución del agente aclarante por parafina. Por calor, el agente aclarante se evapora y la parafina ocupa su lugar.

Etapas (en estufa a 60ºC):

1. Mezclas de agente aclarante y parafina con concentraciones crecientes de ésta (normalmente 2:1, 1:1 y 1:2) para evitar corrientes de difusión que deterioren el tejido.

2. Parafina pura (generalmente 2-3 pasos).

Condiciones que favorecen la infiltración:

• Vacío: aumenta la velocidad de infiltración y elimina burbujas de aire del tejido (máquinas de procesamiento de tejidos).

• Agitación: aumenta la velocidad de infiltración.

Confección del bloque

Moldes: diversos en tamaño, forma y material.

Etapas:

1. Vertido de parafina líquida.

2. Depósito de la pieza infiltrada.

3. Solidificación completa de la parafina.

4. Confección de la pirámide (RETALLADO DEL BLOQUE).

Microtomía

Proceso de obtención de secciones delgadas de tejido, que se adhieren a una superficie de cristal (portaobjetos) para su examen microscópico.
    • Tejidos incluidos en parafina u otros medios: MICROTOMO.
    • Tejidos congelados: CRIOSTATO (criomicrotomía).

Microtomo

Instrumento de precisión en el que el tejido se hace avanzar una distancia predeterminada, seguido de un deslizamiento sobre el filo de una cuchilla, para obtener una sección cuyo grosor es la distancia avanzada por el tejido.

Tinción

Las estructuras tisulares no pueden detectarse con el microscopio óptico convencional, debido a que el índice de refracción de todas ellas es similar: es necesario crear artificialmente un contraste diferencial entre los diversos elementos del tejido.

Tipos de técnicas de tinción

• Técnicas de coloración: Las moléculas usadas son colorantes, que se fijan selectivamente a diferentes partes del tejido sin una significativa alteración de la estructura molecular de los mismos.

• Técnicas de impregnación: Las moléculas usadas son compuestos metálicos, visibles o no, que se incorporan selectivamente a diferentes partes del tejido, siendo posteriormente revelados cuando no son visibles.

Colorantes

moléculas orgánicas, generalmente con anillos aromáticos, que poseen color debido a una absorción selectiva de radiación luminosa de un determinado rango de longitud de onda del espectro visible.

Clasificación de colorantes