5 molek paks. replikacija

Kokia gali būti replikacija?

vienkryptė, dvikryptė

Ląstelinių genomų replikacija dažniausiai yra…

dvikryptė

kas yra Replisoma?

Replisoma – baltymų kompleksas, susidarantis ties replikacine šakute, ir vykdantis DNR replikaciją

DNR polimerazės sintetina DNR tik 5’→3’ kryptimi. Todėl DNR duplekse negalima nenutrūkstama abiejų dukterinių DNR grandinių sintezė. Kaip sprendžiama kitos grandinės sintezės problema?

• Replikacinėje šakutėje grandinės vadinamos:

  • Pirmaujančioji (leading)

  • Vėluojančioji (lagging)

• Pirmaujančioji sintetinama nenutrūkstamai

• Vėluojančioji sintetinama trumpais fragmentais (Okazaki fragmentais), kurie vėliau sujungiami į ištisinę DNR grandinę

Kokie yra replikacijos etapai?

• Iniciacija

• Elongacija

• Terminacija

iniciacija

• Replikacija pradedama tam tikrose vietose:

  • Gausu AT

  • Neigiama superspiralizacija

• Pradžios vietos yra fiksuotos:

  • Dauguma prokariotų turi 1 pradžią žiedinėje chromosomoje

  • Kai kurios archėjos turi kelias

  • Eukariotai turi daug vietų kiekvienoje chromosomoje, dažniausiai kas 50 kb

• Specialūs baltymai atpažįsta, išskiria DNR tam tikroje vietoje, prasideda dvikryptė replikacija

• Replikacijos iniciacijai svarbu, kad DNR grandinės būtų išskirtos, ir stabilizuotos tokioje pozicijoje

elongacija. kas tai. Kas atlieka elongaciją. ir pan

• Elongacijos etapas – DNR ilginimas

• Atlieka replisoma

  • Nepakanka tik polimerazės, reikalingas daugelio baltymų kompleksas

  • Išskiria DNR grandines toliau

  • Sintetina naująja grandine (abiem išskirtoms grandinėms)

• Kadangi DNR grandinės antiparalelios, replikacijos metu skirtingai turi būti sintetinama pirmaujanti ir vėluojanti grandinės

terminacija

• Elongacijos pabaigoje sutvarkoma vėluojanti grandinė:

  • Pašalinami RNR pradmenų likučiai

    • Pol I, dėl savo 5‘-3‘ egzonukleazinio aktyvumo

    • Ribonukleazė H (skaldo RNR-DNR hibridinės molekulės RNR dalį)

  • Plyšiai sujungiami

    • DNR ligazė

• Terminacija – pasibaigus replikacijai, baltymu kompleksai ją užbaigia, chromosomos paskirstomos po dukterines ląsteles

Replikacijos trombono modelis

Kas čia

e.coli DNR helikazė

DNR helikazės

• DNR helikazės yra nuo DNR priklausomos ATP -azės

• DNR grandinių išskyrimui naudoja ATP hidrolizę: vyksta DNR grandinės traukimas per helikazę

• Helikazės gali judėti 5’ →3’, arba 3’ →5’ kryptimi (ant vienos arba ant kitos DNR grandinės )

E. coli helikazė, kaip vadinasi, viskas apie ją

• DnaB

• E. coli replikatyvinė helikazė – heksameras. Sudaro žiedą apie vieną iš DNR duplekso grandinių

• Dėl ATP jungimo ir hidrolizės, keičiasi helikazės erdvinė struktūra

• Dėl tokių pokyčių, helikazė juda išilgai DNR grandinės, o kita grandinė lieka išorėje

• E. coli helikazė juda ant grandinės, pagal kurią sintetinama vėluojančioji grandinė (5’→ 3’ kryptimi)

Su viengrandine DNR susirišantys baltymai SSB

• Rasti visuose organizmuose, nuo bakterijų iki žmogaus (taip pat virusuose)

• Apsaugo atskirtas DNR grandines nuo:

  • Reasociacijos

  • Antrinių struktūrų susidarymo

  • Nukleazių poveikio

E. coli SSB baltymai. savybės. funkcijos

• E. coli SSB baltymas turi OB domeną, kuriuo prisijungia prie viengrandinės DNR

• Homotetrameras

Funkcijos be viengrandinės DNR apsaugojimo:

• Svarbūs užtikrinti pirmaujančiosios ir vėluojančiosios grandinių sintezės koordinaciją

• Nukreipia praimazę ties ta DNR vieta, kur bus sintetinamas pradmuo ir neleidžia praimazei per anksti sintetinti pradmens vėluojančioje grandinėje

• ŽUK komplekso chi subvienetas konkuruoja su praimaze dėl sąryšos su SSB baltymais, ir tokiu būdu ją pašalina nuo RNR pradmens, kai reikia prijungti žiedą beta

• SSB stimuliuoja DNR polimerazę ir helikazę.

DNR praimazės. bendrai. kas tai. kaip yra pas eukariotus ir prokariotus

DNR praimazės - specialiós klasės RNR polimerazės, dalyvaujančios replikacijoje:

• Bakteriofagų ir bakterijų – sąveikauja su helikaze;

• Eukariotų – asocijuotos kartu su DNR polimeraze (pvz., DNR polimerazė a/praimazė).

DNR polimerazėms reikia matricos/pradmens komplekso, RNR polimerazėms – NE!

Kaip praimazės sintetina pradmenis?

Praimazės sintetina RNR pradmenis de novo ties tam tikromis savitomis sekomis.

• Skirtingai nuo DNR polimerazių, praimazėms nereikia pradmens 3‘OH, užtenka matricos

• Būdingas nedidelis (dažniausiai 2–3 nukleotidų) matricinės grandinės sekų savitumas

• Procesyvumas mažas – sintetina tik apie 11 nt RNR pradmenį

kaip vadinasi E.coli praimazė?

DnaG

E. coli praimazė DnaG. jos struktūra.

Struktūra:

• Cinko pirštų motyvą turintis ZBD domenas N -gale , reikalingas sąveikai su DNR

• Su DNR helikaze sąveikaujantis HBD domenas C -gale

• RNR Polimerazės domenas

ką daro praimazės DnaG sąveika su DNR helikaze ?

• Praimazės DnaG sąveika su DNR helikaze padidina DNR helikazės DnaB aktyvumą (ir ATP -azės ir helikazės )

ką daro helikazė ssijungus su praimaze DnaG

• DNR helikazė, savo ruožtu, aktyvina praimazę, valdo kur ir kiek pradmenų praimazė sintetina

Ką daro šerdinės dalelės dalys DNR Polimerazėje III

DNR Polimerazė III (DNR Pol III). Bakterijos replisomą (holofermentą) sudaro:

DNR polimerazės III dalel ė s :

• Dvi dalelės holofermente

• Po vieną pirmaujančios ir vėluojančios DNR grandinių sintezei

Slystantieji žiedai

• Du žiedo β monomerai sąveikauja tarpusavyje “galva-uodega” principu ir sudaro žiedo pavidalo dimerą, turintį ~35 Ǻ ertmę

• Žiedo vidinį paviršių iškloja baltymo α -spiralės, šis paviršius įkrautas teigiamai

β slystantis žiedas slysta DNR molekule ir neleidžia polimerazės aktyvumu pasižyminčioms dalelėms disocijuoti (didina procesyvumą )

Okazaki fragmentų brendimas bakterijose

• DNR III polimerazė baigia sintetinti Okazaki fragmentą vėluojančioje grandinėje ir prieina prieš tai susintetinto fragmento RNR pradmenį;

• DNR Pol III disocijuoja, ją pakeičia DNR I polimerazė, kuri išstumia ir savo 5’→3’ egzonukleaziniu aktyvumu suardo RNR pradmenį

• DNR Pol I tuo pat metu vietoje išstumtojo pradmens tiksliai susintetina DNR

• DNR Pol I, susintetinusi ~ 10-12 nt.; disocijuoja

• Plyšį (nick) sujungia DNR ligazė

Bakterijų DNR polimerazė I

• 1 polipeptidinė grandinė

• Trys polimerazės kataliziniai aktyvumai išsidėstę skirtinguose fermento aktyviuose centruose

• Daline baltymo proteolize tripsinu ir subtilizinu baltymas suskaldomas į du fragmentus:

  • • didesnį – 605 aminorūgščių •

    • 5 ’ →3’ DNR polimerazinis akt.

    • 3 ’ → 5’ egzonukleazinis akt.

  • mažesnį – 323 aminorūgščių

    • 5 ’ → 3’ egzonukleazinis akt.

Kokios yra pagrindinės Bakterijų DNR polimerazės I funkcijos?

• DNR pažaidų reparacija

• Okazaki fragmentų brendimas

Eukariotų replikatyvinė helikazė. Kiek ir kokių baltymų ją sudaro?

Aktyvią helikazę sudaro 11 baltymų:

• Cdc45 baltymas

• MCM 2-7 baltymai (šeši, heteroheksameras)

• GINS baltymai (keturi, heterotetrameras).

kaip vadinama Eukariotų replikatyvinė helikazė?

CMG helikaze

kas yra MCM baltymai?

MCM baltymai yra ATP-azės (C-gale)

Kur veikia CMG helikazė ją aktyvinus?

Aktyvinus CMG helikazę, ji veikia ant vienos DNR grandinės (pagal kurią sintetinama pirmaujančioji grandinė). Ji juda 3’ → 5’ kryptimi

Eukariotų replikacinė šakutė visas mechanizmas

• Replikatyvinė helikazė CMG

• Viengrandinė DNR apsaugoma RPA baltymų

• DNR Pol a/ praimazė sintetina RNR-DNR pradmenis

• Žiedo užkėlimo kompleksas RFC ties kompleksu pradmuo/matrica jungia PCNA slystantį žiedą

• DNR polimerazės ε ir δ sintetina pirmaujančiąją ir vėluojančiąją grandines

Su viengrandine DNR susirišantys baltymai eukariotuose. kaip vadinasi? kokia struktūra? kur dalyvauja? nuo ko apsaugo?

• Eukariotų RPA baltymas

• Prie viengrandinės DNR prisijungiantis baltymas (bakterijų SSB analogas)

• Heterotrimerinė struktūra

• RPA struktūroje – iš viso šeši OB domenai

• Dalyvauja replikacijoje reparacijoje, rekombinacijose

• Apsaugo DNR nuo nukleazių poveikio ir segtukų susidarymo

Eukariotų DNR polimerazė a/praimazė. sturktūra

• Sudaryta iš keturių baltymų:

  • Praimazės (du Pri subvienetai)

    • Didysis PriL

    • Mažasis PriS

  • DNR polimerazės a

  • B subvieneto

-

• Praimazę su DNR Pol a jungia lankstus DNR Pol a C-galinis domenas

• Manoma, dėl šio domeno praimazę, susintetinusią RNR pradmenį, pakeičia DNR Pol a, nedisocijuojant fermentui nuo matricos.

Eukariotų DNR polimerazė a/praimazė funkcija

Sintetina RNR-DNR pradmenis vėluojančioje grandinėje

Pradmenys mišrūs:

• trumpas ~10 nt. RNR fragmentas (praimazė)

• ~20-30 nt. DNR fragmentas – iniciatorinė DNR (DNR polimerazė a)

Praimazė sintetina RNR pradmenį

Polimerazė a pratęsia sintetindama DNR

Eukariotų slystanty sis žiedas. kaip vadinasi? Kokia struktūra? funkcija?

• PCNA baltymas (proliferating cell nuclear antigen )

• Homotrimeras

• Funkcionuoja kaip DNR polimerazių procesyvumo veiksnys

• Svarbus reguliacijai:

  • Įvairių potransliacinių modifikacijų taikinys

  • Sąveikauja su DNR reparacijoje dalyvaujančiiais baltymais

  • Sąveikauja su ląstelės ciklo valdymo baltymais

• Ant DNR užkelia RFC baltymų kompleksas

Eukariotų žiedo užkėlimo kompleksas. kaip vadinasi? struktūra? Kur gali užkelti PCNA žiedą?

• Heteropentameras (RFC 1-5)

• Baltymai yra ATP-azės

• Gali užkelti PCNA žiedą:

  • Ant matricos-pradmens komplekso replikacijos vietose

  • DNR trūkių vietose

Eukariotų DNR polimerazės

• DNR polimerazės ε ir δ sintetina pirmaujančiąją ir vėluojančiąją grandines

DNR Pol ε– daugiausiai sintetina pirmaujančiąj ą

DNR Pol δ – vėluojančiąją grandinę.

Okazaki fragmentų brendimas eukariotuose

• DNR Pol δ išstumia priekyje esančio Okazaki fragmento pradmenį:

  • Susidaro trumpa “uodega” (flap) (1-2 nt.)

  • DNR Pol δ procesyvumas krenta

• FEN1 -”uodegos” struktūrai atranki endonukleazė

  • Nukerpa trumpą išstumtą viengrandinį fragmentą

• Likusį plyšį sujungia DNR ligazė I

Okazaki fragmentų brendimas eukariotuose. Kas nutinka Jeigu Pol δ išstumia ilgą uodegą?

• Prisijungia Pif1 šeimos helikazė

• Išstumia Okazaki fragmento pradmenį

• Susidaro ilga uodega

• Padengiama RPA baltymais

• Šalina nukleaz ė /helikaz ė Dna2 .