Nanobiotechnologia (copy)

Przeciwciała

Grupa białek wytwarzanych przez komórki plazmatyczne (limfocyty B), służące do neutralizacji patogenów

Wiążą antygen

Antygen

Składa się z:

• białka

• polisacharydu

• Epitop - fragment rozpoznawany przez układ odpornościowy

• czasem lipid lub kwas nukleinowy

Wiązane przez limfocyty B na powierzchni patogenu

np. białko kolcowe (S)

Po kontakcie z nim powstają limfocyty pamięci, które przyspieszają reakcję układu przy następnym zachorowaniu

Limfocyty

Komórki układu odpornościowego odpowiedzialne za swoistą odpowiedź immunologiczną

B:

• produkcja przeciwciał

• Rozpoznanie antygenów w płynach ustrojowych

• różnicują się w komórki plazmatyczne

T:

• T helper: koordynatorzy odpowiedzi immunologicznej - aktywują limfocyty B i inne

• T cytotoksyczne: zabijają zakażone komórki

• T regulatorowe: hamują nadmierną odpowiedź, utrzymują tolerancję immunologiczną

NK (natural killer):

• zabijają zakażone komórki

• nie wymagają wcześniejszej aktywacji antygenem

Budowa przeciwciał

Constant domain of light chain: bogate w beta-sheets, 2 beta-arkusze stabilizowane mostkiem disiarczkowym

Łańcuchy lekkie z ciężkimi stabilizowane mostkiem disiarczkowym

Łańcuchy ciężkie między sobą też stabilizowane mostkiem disiarczkowym

Miejsce wiązania antygenu (dwa na jedno przeciwciało) jest tworzone przez lekki i ciężki łańcuch razem

Dwie domeny Fab (fragment antigen binding) połączone bardzo giętkim linkerem, żeby bardziej efektywnie wyłapywać antygeny różnych struktur przestrzennych

• VL = variable light chain domain

• VH = variable heavy chain domain

• CL = constant light chain domain

• CH = constant heavy chain domain

• scFv - single chain Fragment variable = jeden VH plus jeden VL

Nanoprzeciwciała

Przeciwciała otrzymywane z przeciwciał składających się z jedynie łańcucha ciężkiego

Ich charakterystyczną cechą jest brak łańcucha lekkiego, posiadają zróżnicowaną liczbę fragmentów stałych i umiejscowienia mostków dwusiarczkowych

Fragment zmienny jest bardzo mały, ma jedynie 12-15kDa, prosty w ekspresji w bakteriach i oczyszczaniu

Występuje dłuższy fragment CDR3 - Wiążą się preferencyjnie w miejsca aktywne enzymów i zagłębieniach na powierzchni białek (bo są małe i mają długi pojedynczy łańcuch CDR3)

Naturalnie występują w gatunkach wielbłądowatych i ryb chrzęstnoszkieletowych

Powstawanie przeciwciał w organizmie

1. Naive IgM+, IgD+ B cells spotykają mikroby (rozpoznanie antygenu) -> activated B cells -> helper T cells i inne czynniki stymulujące wywołują proliferację activated B cells -> różnicowanie (dojrzewanie) komórek do:

• Antibody-secreting plasma cells (sekrecja przeciwciał)○

• Produkcja komórek pamięci memory B cells○

• Produkcja IgG, IgM
  

2. Repertuar przeciwciał generowany jest w procesie rekombinacji genetycznej. Jest to jedyny przypadek rekombinacji DNA poza podziałem mejotycznym
   
   Ponadto geny kodujące przeciwciała wykazują liczne mutacje prowadzące do jeszcze większego poszerzenia liczby potencjalnych przeciwciał, które mają wysokie powinowactwo do antygenu

Otrzymywanie przeciwciał w labie

1. Wstrzyknięcie antygenu np. białka, komórki z innego organizmu, związki

   małocząsteczkowe, peptydy do organizmu w jakim chcemy produkować przeciwciała

2. Izolacja krwi/organu, w którym produkowane są limfocyty wytwarzające przeciwciała, w których oczyszcza się te komórki

3. Fuzja z komórkami szpiczaka mnogiego
   - nieśmiertelne
   - wyselekcjonowane, by nie produkowały własnych przeciwciał oraz nie posiadały aktywnego genu kodującego fosforybozylotransferazę hipoksantynowo-guaninową (HGPRT) odpowiedzialnego za syntezę nukleotydów de novo z hipoksantyny i doeksytymidyny
   - komórki powstałe metodą fuzji nazywa się hybrydomą

4. Selekcja komórek posiadających HGPRT w pożywce blokującej syntezę nukleotydów (HAT)

5. Selekcja klonów produkujących przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi podanemu przy immunizacji

IgG

najważniejsza i najliczniejsza grupa przeciwciał we krwi (ale nie na ogół)

IgM

Przeciwciała wytwarzane jako pierwsze przez limfocyty B

Pentamer - zwiększa powinowactwo, połączony łancuchem J

IgA

Przeciwciała wytwarzane na powierzchni błon śluzowych. Przeciwdziałają kolonizacji błon śluzowych przez patogeny. Ilościwo przeciwciał IgA jest więcej niż pozostałych typów razem wziętych

Dimer połaczony łańcuchem J (łączy dwa fragmenty Fc)

IgE

Przeciwciała skierowane przeciwko pasożytom. Zaangazowane w procesy alergiczne.

Mają dodatkową domenę

IgD

aktywacja limfocytów B, ich funkcja nie jest dobrze poznana

Mimetyki

• Białka tworzone sztucznie (metodami inżynierii genetycznej)

• Warianty naturalnie występujących białek

• Relatywnie małe, łatwe w produkcji i oczyszczaniu

• Stabilne w wysokich temperaturach, pH itp.

• Podobnie jak przeciwciała można wykorzystać do wiązania antygenów

• W przeciwieństwie do przeciwciał nie oddziałują z receptorami układu odpornościowego

• Możliwe stworzenie biblioteki tak jak dla przeciwciał

• Selekcję mimetyków można przeprowadzać np. poprzez prezentowanie fagowe, drożdżowe, rybosomowe

Znaczenie białek A, G i L w nanobiotechnologii

Wiążą immoglobulinę

Białka A i G z bakterii S. aureus wiążą się do rejonu Fc przeciwciał - są ustawione tak, żeby dawać dostępność do wiązania z rejonem Fc IgG

Białko L z P. magnus wiąże się z łańcuchem lekkim typu kappa

Pokrywając nanocząstkę takim białkiem zwiększamy powinowactwo do przeciwciał, potrzebne

mniej przeciwciał do uzyskania takiego samego powinowactwa -> TANIEJ!

Zastosowania przeciwciał w nanotechnologii

• Znaczniki do wykrywania różnych substancji w testach diagnostycznych

• Precyzyjne dostarczanie systemów terapeutycznych do wybranych typów komórek, np. nowotworowych oraz środków kontrastujących w celu obrazowania, np jony gadolinu w MRI (paramagnetyczny środek kontrastowy w rezonansie magnetycznym)

• Inteligentne nanomateriały

• nanomaszyny

Digoksygenina

Kontroluje oddziaływania DNA poprzez łączenie z przeciwciałami

organiczny związek chemiczny z grupy steroidów. Stosowana jest jako nieradioaktywny marker w badaniach kwasów nukleinowych

Proces prezentacji fagowej i selekcji scFv

scFv - Single chain Fragment variable - część przeciwciała odpowiedzialna za wiązanie antygenu

Możliwe jest stworzenie biblioteki sztucznych przeciwciał, bazując na tym, że genom posiada skończoną liczbę genów przeciwciał, a większość fragmentów V łańcuchów przeciwciał różni się jedynie w fragmentach CDR (complementary determining region) 1, 2 i 3.

Wiążąc antygen na podłożu można wyselekcjonować fagi, które mają na powierzchni scFv wiążące antygen, po kilku rundach selekcji można odczytać sekwencję VL i VH i stworzyć sztuczne przeciwciało na bazie innego przeciwciała podmieniając fragmenty VL i VH

Otrzymane fragmenty przeciwciał są ludzkiego pochodzenia

przeciwciała humanizowane

Sztuczne przeciwciała, powstające w wyniku inżynierii genetycznej

Przeciwciała z innych organizmów są rozpoznawane przez ludzki układ odpornościowy jako antygen i usuwane z krwiobiegu, dlatego przeciwciało terapeutyczne powinno jak najbardziej przypominać ludzkie

Przeciwciała zhumanizowane zawierają większość sekwencji ludzkiego przeciwciała i jedynie fragmenty wiążące antygen, np. VL, HL są z oryginalnego przeciwciała otrzymanego np. z myszy

Można też wymienić fragmenty CDR jeżeli znamy dokładnie miejsce wiązania antygenu przez oryginalne przeciwciało

Zhumanizowane ciało nie jest rozpoznawane przez ludzki układ odpornościowy

SARS-CoV 2

• Jednoniciowa cząsteczka RNA+

• ACE2 - enzym błonowy, receptor niezbędny do wniknięcia wirusa do komórek człowieka (błuca, jelita, nerki, serce)

• lipidowa otoczka

• Spike glycoprotein (biało S) na powierzchni wirusa

• Wejście ułatwione przez proteazę białkową TMPRSS2, która tnie białko kolca (S), co powoduje zmianę strukturalną skutkującą fuzją z błoną lipidową

rola białka kolca w cyklu życiowym wirusa SARS CoV 2

Białko kolca (S) jest celem przeciwciał neutralizujących wirus, gdzie blokują jego wiązanie z ACE2, które wspomaga fuzję błon z gospodarzem

struktura białka kolca

jest silnie glikozylowanym białkiem transbłonowym tworzącym homotrimer. Każdy monomer składa się z podjednostek S1 i S2. Podjednostka S1 zawiera domenę wiążącą receptor (RBD), która rozpoznaje receptor ACE2 na powierzchni komórek gospodarza. Podjednostka S2 odpowiada za fuzję błony wirusa z błoną komórki. Liczne glikany tworzą ochronną „tarczę glikanową”, maskując epitopy przed układem odpornościowym oraz wpływając na stabilność białka

homotrimer - 3 identyczne jednostki (oligomer) połączone w jeden kompleks - to on jest kolcem

S1 odpowiada za rozpoznawanie komórki, składa się z NTD (N-terminal domain) i RBD (Receptor Binding Domain)

S2 odpowiada za przyłączenie i fuzję błon, składa się z peptyd fuzyjnych, regiony HR1 i HR2 i domeny transbłonowej

Glikany - krótkie łańcuchy cukrowe przyłączone do białka, powstające przez N-glikozylację na resztach asparaginy, stabilizują strukturę białka, tworzą tarczę glikanową przez co układowi odpornościowemu ciężej rozpoznać wirus

RBD wiąże ACE2, co zmienia konformację kolca i aktywuje proteazę TMPRSS2, przez co następuje fuzja błon lipidowych i RNA może wejść do komórki gospodarza, może występować w sanie zamkniętym “down” (cięższe łączenie z ACE2 ale mniejsza widoczność dla przeciwciał) i stanie otwartym “up” (wiązanie ACE2, większa zakaźność i ekspozycja na przeciwciała)

Typy szczepionek przeciw SARS CoV 2

• Rekombinowane białko S - różne formulacje białka S stosowane jako antygeny - układ odpornościowy rozpoznaje jako obce

• mRNA - produkuje białko S (antygenu) przez komórki organizmu w celu pobudzenia odporności limfocytów B i limfocytów T

• Adenowirus - niereplikujący, wektor adenowirusowy dostarcza materiał genetyczny kodujący białko S do komórek, które następnie produkują białko S (antygen), pobudzając odpowiedź limfocytów B i T

• DNA produkujące białko S - pobudzenie odporności limfocytów B i T

• Zdezaktywowany wirus - rozpoznawanie unieczynnionego wirusa przez układ odpornościowy

• Różne adjuvanty (w celu niespecyficznego pobudzenia układu odpornościowego)

Remdesivir

jest lekiem będącym analogiem nukleotydu, pierwotnie opracowanym do leczenia zakażeń wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV), a następnie testowanym w badaniach klinicznych przeciwko wirusom Ebola i Marburg.

Jest inhibitorem wirusowej replikazy, czyli polimerazy RNA zależnej od RNA (RdRp, RNA-dependent RNA polymerase).

Remdesivir przypomina naturalny nukleotyd używany do syntezy RNA. Gdy polimeraza przez pomyłkę wbuduje go do powstającej nici RNA, dalsza synteza zostaje zaburzona lub zatrzymana - wirus nie może skutecznie kopiować swojego genomu

szczepionka mRNA

1. linearyzacja plazmidu

2. transkrypcja in vitro - przez polimerazę RNA pochodzącą z bakteriofagów na matrycy plazmidowego DNA.

3. dodanie czapeczki 5’ - stabilizuje mRNA i podwyższa translację wiążąc EIF4E (eukariotyczny inicjator translacji 4E)

4. zastosowanie zmodyfikowanych nukleozydów

5. dodanie ogona poli(A) - stabilizuje i podwyższa translację

6. oczyszczenie mRNA chromatografią - obniża odpowiedź układu odpornościowego i podwyższa translację

7. zamknięcie w nanocząsteczkach lipidowych (LNP)

Zalety:

• Szybkie projektowanie i produkcja

• Nie zawierają żywego wirusa

• Silna odpowiedź układu odpornościowego

• Łatwość modyfikacji

• Brak integracji z genomem - funkcjonuje w cytoplaźmie

Wady:

• Bardzo niestabilne

• Problemy z przechowywaniem i transportem - potrzebna niska temperatura

• Konieczność nośników

• Krótkotrwała obecność w organizmie - rozkład po kilku dniach

• Źle oczyszczona może obniżać skuteczność i powodować stany zapalne

Zastosowania nanocząstek

• Ciecze magnetyczne

• Nośniki danych

• Diagnostyka medyczna

• Nanosensory

• Katalizatory

• Nanokompozyty

Kropki kwantowe

nanocząstki poniżej 10 nm

Półprzewodniki cechujące się wydajnością kwantową, wąskie spektrum emisji światła

np. diody led

Koprecypitacja

Metoda otrzymywania nanocząstek magnetycznych

wysoka wydajność ale słaba kontrola kształtu i stosunkowo wąski zakres rozmiarów

mieszania żelaza na II i III stopniu utlenienia w np. amoniaku, a powstające wodorotlenki rozkładają się do tlenków

Rozkład termiczny

Metoda otrzymywania nanocząstek magnetycznych

Wysoka wydajność, bardzo dobra kontrola kształtu, bardzo wąski rozkład rozmiarów

Mikroemulsja

Metoda otrzymywania nanocząstek magnetycznych

Niska wydajność, dobra kontrola kształtów, stosunkowo wąski zakres rozmiarów

w odpowiednich warunkach stworzenie emulsji z bardzo jednorodnym rozkładzie kropli

Synteza hydrotermalna

Metoda otrzymywania nanocząstek magnetycznych

Średnia wydajność, bardzo dobra kontrola kształtu, bardzo wąski zakres rozmiarów

synteza nanocząstek w bardzo wysokiej temperaturze w wodzie w reaktorze chemicznym (stalowe naczynie pokryte teflonem, szczelnie zamknięte i podgrzeawane) -> woda znajduje się powyżej temperatury wrzenia, ale podwyższone ciśnienie powoduje, że woda nie wrze; w takich takich warunkach może zajść synteza tlenku cynku (powstający w reaktorze wodorotlenek cynku ulega rozkładowi do tlenku cynku)

Magnetotaksja

Zdolność bakterii do orientowania się wzdłuż linii pola magnetycznego z wykorzystaniem magnetosomów - porusza się góra-dół wobez głębokości wody

Dostosowane do półkuli, na której przesiadują - po przeniesieniu na inną poruszają się w innym kierunku

Magnetosomy

• organellum występujące w niektóryh bakteriach

• otoczone otoczką lipidową, w której można zakotwiczyć białko

• w proces formowania zaangażowane są geny mamK i mamJ

• składają się z magnetytu (Fe3O4) albo greigitu (Fe3S4)

• magnetyt ma różną morfologię w zależności czy są organiczne czy syntetyczne

• używane w diagnostyce:

-Testy immunodiagnostyczne

-Układy receptorowe do testów nowych leków

-Separacja komórkowa

-Oznaczanie polimorfizmów jednonukleotydowych (SNPs) - choroby genetyczne

-Oddzielanie DNA/RNA

-Przenoszenie leków

-Sondy magnetyczne

-Budowa mikroskopów sił magnetycznych

budowa dwuwarstwy fosfolipidowej i fosfolipidu

rola i wpływ cholesterolu na dwuwarstwę lipidową

• Składnik błon komórkowych u zwierząt

• Wbudowuje się między fosfolipidy - grupa OH przy główkach, pierścień w ogonach

• Kontroluje (ogranicza) ruch dwuwarstwy fosfolipidowej - w wysokiej temperaturze fosfolipidy poruszają się bardzo intensywnie

• Zwiększa uporządkowanie - fosfolipidy bardziej proste a błona z lekka grubsza

• Zmniejsza płynność w wysokich temperaturach i utrzymuje ją w niskich

• Poszerza zakres temperatur w których błona pozostaje funkcjonalna - zapobiega krystalizacji i przejściu błony w stan żelowy w niskich temperaturach

• Uszczelnia miejsca w błonie gdzie mogą przejść pierdoły

• Wzmacnia strukturę - odporność na uszkodzenia mechaniczne i odkształcenia

• Tratwy lipidowe - przekazywanie sygnałów, endocytoza

• LDL - transport cholesterolu z wątroby do tkanek (odkładanie w naczyniach)

• HDL - przenosi cholesterol z tkanek do wątroby

faza lamelarna

• Uporządkowana struktura utworzona przez amfifilowe cząsteczki (np. fosfolipidy), które samorzutnie organizują się w równoległe dwuwarstwy lipidowe oddzielone warstwami wody

• Jeżeli lipidów jest dużo, warstw tworzy się wiele i powstaje faza lamelarna

• Podczas uwadniania suchych lipidów tworzą się warstwy lamelarne, które zamykają się w pęcherzyki - liposomy

• MLV - multilamellar vesicles - pęcherzyki o wielu dwuwarstwach (z fazy lamelarnej)

• MLV można rozdzielić sonikacją lub ekstruzją na takie z jedną dwuwarstwą czyli SUV (small unilamellar vesicles) lub LUV (Large unilamellar vesicles)

• Umożliwia przenoszenie nanonośników (np Doxil - doksorubicyna w liposomie)

• Zamyka się w nich szczepionki mRNA (lipidy jonizowane)

Oprócz warstw lamelarnych lipidy tworzą też fazę micelarną (micele) i fazę heksagonalną odwróconą HII (kanały wodne otoczone lipidami)

Liposomy

Pęcherze lipidowe

Można w środku przenosić zarówno substancje hydrofilowe i hydrofobowe

Nie są stabilne podczas przechowywania

Mogą się agregować

Szybko usuwane z systemu (chyba że PEGylowane)

Dzielą się na:

• MLV - wiele dwuwarstw

• SUV - mały, o pojedynczej warstwie

• LUV - duży o pojedynczej warstwie

• GUV - olbrzymi (1 μm średnicy) o jednej warstwie

• konwencjonalne - zwykłe fosfolipidy z cholesterolem

• PEGylowane - zawierające polietylenoglikol (PEG) na powierzchni - dłuższy czas krążenia we krwi, mniejsze wychwytywanie przez fagi

• immunologiczne - z przeciwciałami i/lub ligandami receptorowymi na powierzchni

• kationowe - dodatnio naładowane lipidy, przenoszą kwasy nukleinowe (lipopleksy) - popularny sposób transfekcji - wprowadzenie obcego materiału genetycznego

• metalosomy - wiążące metale, np. jony gadolinu kontrastujące w rezonansie jądrowym, który dzięki lipidom lepiej wnika przez komórki nowotworowe

Zastosowanie:

• sztuczna krew

• powstrzymanie utleniania kropek kwantowych

• farmakologia

• terapia fotodynamiczna

Surfaktanty i mieszaniny w terapii genowej

• Surfaktanty są powierzchniowo czynne i amfifilowe - lokują się na granicy faz, zmniejszając napięcie powierzchniowe

• Tworzą kompleksy z kwasami nukleinowymi - kationowe surfaktanty, lipidy kationowe

• Tworzą lipopleksy - skondensowane DNA/RNA otoczone lipidami

• Umożliwiają transfekcję - pomagają w endocytozie

• Umożliwiają samoorganizację lipidów w fazy lamelarne

• Niektóre ułatwiają uwolnienie DNA/RNA do cytoplazmy, destabilizując błonę endosomu

• Tworzy się mieszaninę z fosfolipidem DMPC (neutralny), który ułatwia surfaktantom (kationowym) micelizację

• małokątowe rozpraszanie promieni X pomaga na ocenę micelizacji

• Rodzaje syrfaktantów

-Kationowe - wiążą DNA/RNA, chronią je przed degradacją, ale mogą być toksyczne

-Niejonowe - stabilizują układy i nanoformulację, zmniejszają toksyczność

-Jonizowane lipidy - w kwaśnym pH wiążą RNA (szczepionki), w fizjologicznym pH są mniej więcej neutralne - mniej toksyczne niż kationowe

-Gemini - można je podzielić symetrycznie na dwie takie same cząsteczki surfaktantu

• typowy skłąd szczepionki mRNA - lipid jonizonowany, fosfolipid strukturalny, cholesterol, PEG-lipid

Ocena kompleksowania DNA

p/n - liczba grup fosforanowych do grup NH

podczas elektroforezy wraz ze wzrostem p/n prążek zanika

Terapia genowa

Gdy mutacja wywołuje brak/niedobór ekspresji genu:

• Dostarczenie DNA/RNA/białka

• Retrowirusy - możliwa przypadkowa integracja materiału genetycznego

• Adenowiruzy - możliwa odpowiedź immunologiczna

Gdy mutacja wywołuje gain of function (nadaktywacja białka/zmiany w splicingu)

• siRNA - blokowanie translacji lub przecięcie transkryptu - komplementarne do transkryptu, łączą się z białkiem AGO

• Oligonukleotydy - blokowanie splicingu (lek na SMA) - splicing ma miejsce w jądrze

Najbardziej obiecującym mechanizmem CRISPR-Cas9 i jego pochodne

Różnice między DNA a RNA

RNA:

• jednoniciowe

• dodatkowa grupa 2’ OH - ulega spontanicznej hydrolizie

• niska stabilność

• łatwo degradowane przez RNazy

• wymaga ochrony w nanonośnikach

• wymaga modyfikacji nukleozydów

• lepiej funkcjonuje w cytoplazmie niż DNA

• cytoplazma → translacja → białko

• immunogenność

• nośnik informacji krótkoterminowej

• wykorzystywane do szczepionek i terapii białkowej, szybka ekspresja białek

DNA:

• plazmidy, wektory genowe

• stabilny

• Gorzej funkcjonuje w cytoplazmie - musi trafić do jądra

• cytoplazma → jądro → transkrypcja → RNA → białko

• nośnik musi przejść przez błonę jądrową, ale może być prostszy niż do RNA

• większe cząsteczki

• czasem ryzyko integracji

• mniejsza/wolniejsza odpowiedź immunologiczna

• wykorzystywane do długoterminowej terapii genowej

Co sprawia że kwasy nukleinowe mają podwójną helisę?

• Komplementarność zasad skleja dwie nicie

• podwójna helisa stabilniejsza niż pojedyncza - wiązania wodorowe i oddziaływania stackingowe (π-π)

• Ułożenie zasad daje stabilizację i oddziaływania van der Waalsa

• Hydrofobowa natura zasad azotowych - cukier i fosforan hydrofilowe

• Oddziaływanie elektrostatyczne - Ładunki ujemne w pojedynczej nici odpychałyby się - w helisie są stabilizowane przez jony ekraniające

• Cukry wymuszają skręt struktury

• Generalnie jest najbardziej efektywna energetycznie

motyw strukturalny DNA wykorzystywany do budowy nanostruktur z DNA

Motywem strukturalnym DNA wykorzystywanym w nanotechnologii jest komplementarność zasad azotowych oraz antyrównoległe ułożenie nici, co umożliwia samoskładanie się DNA w przewidywalne struktury. Wykorzystuje się między innymi lepkie końce (sticky ends), skrzyżowania Hollidaya, struktury rozgałęzione oraz technikę DNA origami, która pozwala na projektowanie nanostruktur o określonym kształcie. Dzięki wysokiej specyficzności parowania zasad DNA stanowi programowalny materiał do budowy nanostruktur w nanobiotechnologii

najlepszy sposób na osadzenie DNA na powierzchni złotej elektrody

SAM - samonakładająca się monowarstwa :

• DNA zmodyfikowane grupą SH

• Złoto ma wysokie powinowactwo do siarki

• Au-S jest stabilne i praktycznie nieodwracalne w warunkach fizjologicznych

• DNA układają się pionowo tworząc uporządkowaną warstwę - kontrolowana orientacja

• nieprzywiązane cząstki DNA są dostępne do hybrydyzacji

• backfilling - małe tiolowe cząsteczki stabilizują i wypełniają luki

• zachowuje aktywność biologiczną - wiąże komplementarne sekwencje (sonda)

• wysoka czułość biosensora

Adsorpcja elektrostatyczna

• mniej stabilne

• brak kontroli orientacji

Wiązanie biotyna-streptawidyna

• droższe

zasadę depozycji metalu i tworzenie ich nanostruktur na bazie DNA

DNA wiąże jony metali przez reszty fosforanowe, zasady azotowe (mają wolne pary elektronowe), oraz możliwe modyfikacje chemiczne (np. SH wiążące złoto)

Jony metali są redukowane (neutralizacja ładunku)

Metal używa DNA jako rusztowania, wzrasta wzdłuż niego tworząc nanowłókna, nanodruty, nanoelektrody, struktury 2D i 3D

Metody osadzania i porządkowania DNA na powierzchniach

Czesanie molekularne

○ Cząsteczki DNA osadzone na silikowanym szkle

Rozciąganie elektroforetyczne

○ Jeden koniec immobilizowany

○ Rozciąganie pod wpływem pola elektrycznego

Rozciąganie hydrodynamiczne

○ Jeden koniec immobilizowany

○ Strumień cieczy i związania - lepkość powoduje wyprostowanie się jak sznurek w rzece

origami DNA

Wpierw projektuje się komputerowo by ogarnąć gdzie ma się zginać struktura

Długa nić zazwyczaj wirusowego DNA tworzy rusztowanie

Krótkie zaprojektowane fragmenty DNA przytrzymują rusztowanie (spinacze/szwy)

W roztworze wszystkie nici hybrydyzują jednocześnie, przez co DNA zgina się i składa w kształty 2D i 3D

16 par zasad to półtora obrotu co pozwala zaprojektować „klamry”

Korzysta się ze złącza Holidaya i struktury DX

chromatyna

DNA + histony składają się w nukleosomy, które tworzą pętle chromatynowe, które tworzą chromosom

Upakowują DNA, regulują ekspresję genów, chronią materiał genetyczny

G-kwadrupleksy

Bogate w guaninę sekwencje DNA/RNA, stabilizowane jonami potasu i sodu

Regulują ekspresję genów, służą za przełączniki molekularne w nanotechnologii, stabilizują telomery i regulują telomerazę

struktura Hollidaya

Czteroniciowa struktura DNA powstająca podczas rekombinacji homologicznej

mają znaczenie w wymianie fragmentów DNA, naprawie DNA i węzeł w origami DNA

struktury DX

nanostruktura złożona z dwóch helis DNA połączonych crossoverami

“kręgosłup” origami DNA - stabilne rusztowanie

można też z nich tworzyć siatki 2D DNA

przydają się w transporcie molekularnym

Właściwości elektryczne w DNA

DNA w normalnych warunkach nie jest przewodnikiem, ale w zależności od sekwencji może mieć mniejszą oporność

ładynek ujemny

β-baryłki

Drugorzędowa struktura białek

Antyrównoległe β-wstęgi w strukturze cylindrycznej, gdzie wnętrze często jest hydrofobowe/hydrofilowe

np. poryny (transport), kieszenie (wiązanie ligandów)

Dodają stabilności i odporność na denaturację

Najsilniejsze niekowalencyjne wiązanie

Awidyna - biotyna

Kd ≈ 10⁻¹⁵ M (jedno z najsilniejszych znanych)

• bardzo dobre dopasowanie kształtu

• liczne wiązania wodorowe

• oddziaływania hydrofobowe

• efekt „zamka i klucza”

Zastosowania

• Immobilizacja molekuł

• biosensory - unieruchomienie ligandów

• nanostruktury - “klej” molekularny

• dostarczanie leków - targetowanie

Biała antyzamarzaniowe (AFP)

• Występują np. u ryb arktycznych

• Powierzchnia β-helisy wiąże kryształy lodu (dopasowana powierzchnia) i blokuje dalszą krystalizację

• Obniża temperaturę zamarzania

proces projektowania nowych nano-układów białkowych

1. Przeszukanie bazy danych pdb w celu znalezienia struktur o wymaganej symetrii (trimerów, pentamerów i dimerów), rozdzielczości (<2 Å), ekspresja w bakteriach

2. Dokowanie: liczba kontaktów, (β-atomów węgla reszt aminokwasowych oddalonych o  12 Å)

3. Projektowanie interfejsu (zmiana reszt aminokwasowych i optymalizacja upakowaniań, maksymalizacja powierzchni biorącej udział w oddziaływaniu)

4. Walidacja eksperymentalna: sączenie molekularne (chromatografia), natywna elektroforeza, SAXS, mikroskopia elektronowa, analiza krystalograficzna

• np. klatki ikozahedryczne trzymające inne białka - uwolnienie np dostosowaniem pH

• Badane np. metodą “negative stain” - wybarwienie roztworem mrówczanu uranylu

Lapatynib

organiczny związek chemiczny, inhibitor kinazy białowej stosowany jako lek przeciwnowotworowy w leczeniu guzów raka sutka