wykład 3 biotech mol

metody wprowadzania materiału genetycznego

• wirusowe

• niewirusowe

metody wprowadzania materiału genetycznego niewirusowe

fizyczne

• elektroporacja

• iniekcja

• balistyczne

chemiczne

• liposomy

• polipeptydy kationowe

• polimery

• dendrymery

wprowadzanie materiału genetycznego za pomocą wirusów

• naturalna zdolność wirusów do zakażania komórek

• rekombinowane wirusy, które nie mają zdolności replikacji w komórkach docelowych = tylko w pakujących

• przygotowanie w komórkach pakujących = transfekcja

• zebranie pożywki z wirusami i oczyszczanie/zagęszczenie przez filtrację/wirowanie (w gradiencie CsCl)

• stosowanie polikationów

polikationy np. protamina

w preparatach wirusowych znosi siły elektrostatyczne odpychające pomiędzy negatywnie naładowanymi wirusami i błoną komórkową

adenowirusy jako wektory wirusowe - wady i zalety

• wysoka immunogenność

• duża pojemność

• bezpieczeństwo

wirusy towarzyszące adenowirusom AAV jako wektory wirusowe - wady i zalety

• mała pojemność

• konieczność stosowania wirusów pomocniczych

• stabilna ekspresja

• zmniejszona immunogenność

retrowirusy jako wektory wirusowe - wady i zalety

• mała pojemność

• mutageneza insercyjna

• infekują tylko komórki dzielące się

• stabilna ekspresja

lentiwirusy jako wektory wirusowe - wady i zalety

• mutageneza inercyjna

• infekują komórki dzielące się i nie dzielące się

wirus opryszczki jako wektory wirusowe - wady i zalety

• immunogenność

• duża pojemność

nagie DNA jako wektory wirusowe - wady i zalety

• krótki okres półtrwania

• niska wydajność transfekcji in vivo

• niska immunogenność

liposomy jako wektory wirusowe - wady i zalety

• aktywują procesy zapalne

• niska wydajność transfekcji in vivo

• duża pojemność

rola nośnika niewirusowego

• upakowanie (kondensacja) cząsteczki DNA

• neutralizacja ujemnego ładunku

• ochrona przed degradacją

iniekcja bezpośrednia

DNA lub zmodyfikowane przez transfekcję komórki ES są wprowadzane do pojedynczych komórek lub blastocyst (tworzenie ogranizmów transgenicznych na poziomie przedzarodkowym)

elektroporacja

wprowadzanie polarnych cząsteczek do komórek z zastosowaniem krótkich impulsów elektrycznych, wprowadzane do zawiesiny komórek (komórki krwiotwórcze, macierzyste, linie komórkowe) lub in vivo (mięśnie, wątroba, naczynia)

• hialuronidaza jako wspomaganie

• manipuluje się napięciem i natężeniem prądu

zalety i wady elektroporacji

zalety

• uniwersalność = wiele gatunków i typów komórek

• wydajność = większość komórek ulega transfekcji do 90%

• ekonomiczna = nie trzeba dużo DNA

wady

• destrukcja komórek

• niespecyficzny transport = naruszenie równowagi jonowej

• brak możliwości aplikacji systemowej

balistyczne wprowadzanie materiału genetycznego

drobinki złota lub wolframu pokryte DNA wstrzeliwane do mięśni lub skóry (fala uderzeniowa generowana najczęściej rozprężajacym się gazem)

liposomy

sferyczne, dwuwarstwowe struktury składające się z cząsteczek lipidu obdarzonego ładunkiem + i lipidu obojętnego elektrostatycznie kondensują DNA i neutralizują jego ładunek ujemny (lipopleksy)

fosfolipid składa się z

• ogonu hydrofobowego, kationowoej lub obojętnej głowy

• alkoholu, reszty fosforanowej, reszty kwasu tłuszczowego

liposomy są to

• zamknięte struktury pęcherzykowe zdolne do zamykania roztworów wodnych

• zbudowane z jednej do kilkunastu koncentrycznie ułożonych dwuwarstw lipidowych

• możliwość ich powstawania wynika z właściwości amfifilowych lipidów dwuwarstwy i tym samym samoorganizacji ich struktury dwuwarstwowej w roztworach wodnych

• przez Lehmanna, sztuczne komórki

lipopleksy mogą mieć postać

warstwową

• jednowarstwowe 20nm-2um

• wielowarstwowe 300nm - 20um

60kątną

lamela

jeśli dwuwarstwa nie tworzy układu pęcherzykowego, tylko jest blaszką płaską

polipleks (lipopleks)

jak fosfolipid jako polimer jest połączony z innym polimerem np. z kw. nukleinowym to jest to

• lipopleks jeśli jest lipid

• inaczej polipleks

kategorie liposomów

• wielowarstwowe MLV

• duże jednowarstwowe LUV

• małe jednowarstwowe SUV

• olbrzymie jednowarstwowe GUV

liposomy wielowarstwowe MLV

zbudowane z kilku do kilkuset warstw lipidowych śr. 300nm-20um, widoczne pod mikroskopem świetlnym

liposomy duże jednowarstwowe LUV

duże pęcherzyki otoczone pojedynczą błoną lipidową 80-1000nm średnicy

liposomy małe jednowarstwowe SUV

o śr. 20-80nm

liposomy olbrzymie jednowarstwowe GUV

osiągające kilkaset um średnicy

otrzymywanie liposomów w modelu pączkowania

• pęcherzyki powstają w czasie stopniowego uwadniania suchych lipidów błonowych

• suchy film lipidowy powstały na ściankach naczynia po odparowaniu rozpuszczalnika ma strukturę warstwową, identyczną z dwuwarstwową

• podczas uwadniania takiego filmu cząsteczki wody wnikają pomiędzy poszczególne dwuwarstwy, powodują rozpulchnienie, rozdzielenie, pączkowanie zaczątków pęcherzyków

• dzięki delikatnemu wytrząsaniu odrywają się pęcherzyki typu MLV

konwersja MLV do SUV

• wymaga dostarczenia energii

• sonikacja

• kalibracja

• prasa Frencha

kalibracja

przeciskanie przez membrany o określonej średnicy porów

LUV uzyskuje się

w wyniku kontrolowanej fuzji SUV technikami zamrożeniowo-rozmrożeniowymi i dehydratacyjno-rehydratacyjnymi

otrzymywanie GUV

• elektroformacja

elektroformacja

przyłaczenie prądu zmiennego do specjalnych elektrod, leżących ok. 1mm od siebie na których znajduje się suchy film lipidowy

wielkość liposomów wpływa na

• okres półtrwania - małe = większa stabilność

• zdolność przenikania przez przestrzeń pozakomórkową

• pojemność nośnika

problemy ze stosowaniem tradycyjnych liposomów

• wiązanie z białkami osocza - HDL, LDL, opsoniny
  skutkuje degradacją nośnika za pośrednictwem neutrofilów, makrofagów, monocytów

• aktywacja układu dopełniacza

• toksyczność po powtórnym podaniu

najbardziej powszechny lipid kationowy

lipofektyna (DOTMA)

• manipulujemy ładunkiem monowalentnych

• multiwalentne i kationowe

by uczynić liposomy niewidzialnymi dla układu immunologicznego

napełnia się ich powierzchnię resztami cukrowymi - glikolipidy, gangliozydy

używa się glikolu polietylenowego, co utrudnia opłaszczenie takich lizosmów przez opsoniny

liposomy stealth

• nazywane niewidocznymi z racji zmniejszonej wykrywalności w odniesieniu do układu immunologicznego i przedłużonego czasu krążenia we krwi

• DNA lub lek w nich zawarty może być obecny w ustroju dłużej

• wymagana mniejsza jednorazowa dawka leku

optymalizacja rybosomów do dostarczania chemioterapii (stabilizowane rybosomy)

• Fab’ dla targetingu

• otoczka polimerowa PEG

porównanie liposomów Stealth i MLV

Cecha	Klasyczny liposom (MLV)	Liposom Stealth
Tm	0°C	52°C
Ładunek molekuły	bardzo ujemny	ujemny
Średnica	200–500 nm	100 nm
Warstwowość	wielowarstwowy	jednowarstwowy
Umiejscowienie leku	związany z błoną	Wewnątrz wodnej przestrzeni
Ilość leku	> 0,07 objętości	> 0,25 objętości
Wyciek	silne	nie ma
Przechowywanie	zawiesina i liofilizat	zawiesina
Czas półtrwania	5 min	3 h

liposomy stealth w porównaniu do zwykłych liposomów

• nie są RES - szybkie przechwytywanie przez system endoretikularny

• mają długi czas cyrkulacji we krwi

• nie są gwałtownie wychwytywanie przez komórki wątroby i śledziony i duża ich ilość dociera do celu

zwykłe liposomy

• podatne na RES - szybkie przechwytywanie przez system endoretikularny

• mają krótki czas cyrkulacji we krwi

• są gwałtownie wychwytywanie przez komórki wątroby i śledziony i duża ich ilość nie dociera do celu

zalety liposomów Stealth

• dostarczanie zawartości do miejsc docelowych w dużych ilościach

• chronią zawartość przed degradacją

• chronią organizm przed interakcją z lekiem nie w miejscu docelowym

• mogą uwalniać lek kontrolowanie - zarówno szybko i powoli

• można kontrolować uwalnianie leku w danym miejscu poprzez modyfikację błony liposomów

modyfikacje zwiększające wydajność transfekcji in-vivo

• wbudowany trójpeptyd arginina-glicyna-asparaginian RGD

• wbudowana pochodna mannozylowa cholesterolu

• wbudowane białko fuzyjne wirusa Sendai

• przeciwciało specyficznie reagujące z wybranym antygenem

• kwas foliowy

• transferyna

• PEG

• połączenie z protaminą

wbudowany trójpeptyd arginina-glicyna-asparaginian RGD

oddziałuje z intergynami w naczyniach nowotworowych

wbudowana pochodna mannozylowa cholesterolu

oddziałuje z receptorami mannozowymi - makrofagi

wbudowane białko fuzyjne wirusa Sendai

indukuje fuzje

przeciwciało specyficznie reagujące z wybranym antygenem

kieruje do komórek posiadających dany antygen (receptory specyficzne lub ulegające nadekspresji)

kwas foliowy

liczne receptory na powierzchni komórek nowotworowych

transferyna

liczne receptory na powierzchni komórek nowotworowych

PEG

zwiększenie okresu półtrwania (liposomy Stealth)

połączenie z protaminą

• LPD

• większa wydajność od zwykłych lipidów

• dodatkowo specyficzność dodana przez ligandy docelowych receptorów

• dla hepatocytów = asialofetuina

techniki stosowane do przedłużenia czasu cyrkulacji liposomów Stealth

• usztywnienie dwuwarstwy poprzez wprowadzenie cholesterolu lub sfingomieliny = T ½ wzrasta do 10h

• usianie powierzchni liposomu polimerami (PEG)

usianie powierzchni liposomu Stealth polimerami (PEG)

• zmniejsza/znosi osponizację

• doprowadza do opłaszczenia przez białka immunologiczne

• znaczenie ma długość łańcucha polimeru i jego rozkład na powierzchni

błona liposomu jest ekranowana przed interakcjami np. z białkami osocza tym skuteczniej,

• im gęściej usiana jest polimerem, im jest on dłuższy a jego łańcuchy ruchliwsze

• wzrost dynamiki tego płaszcza polimerowego, zmiany konformacyjne = impulsy do odepchnięcia obcych cząsteczek

konfiguracje PEG w obrębie liposomu sferycznego

białka wiążą się do liposomu

oddziaływaniami niekonwalencyjnymi jak siły van der Waalsa czy hydrofobowe

PEGylowane liposomy mają

• obniżoną możliwość wiązania białek

• trudniej adherować im do powierzchni komórek

• rzędu 5mol% zapobiegają przyłączaniu się białek nawet o tak dużych stałych asocjacji jak streptawidyna wobec biotynylowanych liposomów

wady PEG

• słaba hydrofobowość

• stopniowe uwalnianie z błony

• zanik warstewki ochronnej wokół liposomu

• obniżenie czasu półtrwania

liofilizacja liposomów Stealth

• chronione przed defektami poprzez dodanie krioprotektantów (disacharydy)

• liposomy ulegają uszkodzeniom podczas ponownego uwadniania
  - zmniejsza się ich trwałość i sprawność,
  - wyciek leku

• tym większe uszkodzenie im więcej cykli liofilizacja/rehydratacja

liposomowe i lipidowe leki przykłady

• doxil - doksorubicyna

• abelcet - amfoterycyna B

• daunoxome - daunomycyna

• amphotec - amfoterycyna B

• epaxal-Berna - wirus żółtaczki A

• ambisome - amfoterycyna B

• depocyt - cytarabina

• visudyne - porfiryna (verteporfin)

• myocet - doksorubicyna

immunoliposomy

połączenie przeciwciała może mieć zróżnicowaną formę

transport immunolipoprotein

przez błone komórkową na zasadzie endocytozy, w cytoplazmie uwalnianie liposomów z endosomów

problem z immunoliposomami

• wnikanie do jądra i efektywna ekspresja plazmidu łatwiej w komórkach dzielących się

• w pozostałych komórkach wspomaganie przez wbudowanie sygnału lokalizacji jądrowej NLS

nośniki polipeptydowe

są polikationami i mają zdolność do wiązania DNA

• poli-L-lizyna

• poli-L-ornityna

• protamina (białko)

nośniki polipeptydowe w połączeniu z liposomami

• mogą zwiększać stopień kondensacji DNA i zmniejszać rozmiary kompleksu, ułatwiając wnikanie

• koniugaty z białkiem fuzyjnym GAL4-inwazyna (białko drożdżowe + domena Yersinia pseudotuberculosis)

• stosowane są jako dodatek kondensujący lipopleksy (bez liposomów)

inwazyna INV

• występuje w błonie zewnętrznej pałeczek Yersinia sp.

• bierze udział w adhezji

• wnika do komórek nabłonkowych

• posiada zdolność przyłączenia do beta-1-integryn (na powierzchni komórek M kępek peyer)

inwazyna poprzez przyłączanie do integryn

• stymuluje aktywność GTPazy RhoG = bierze udział w rearanżacji aktyny

• zmiany struktury cytoszkieletu prowadzą do zamknięcia komórek bakteryjnych w endosomie i ich internalizacji

• przebudowa komórki = wciągnięcie fragmentu do komórki

Gal4

• drożdżowy czynnik transkrypcyjny

• dodatni regulator ekspresji genów metabolizmu galaktozy i jej przekształcenia w glukozę

• charakter czynnika transkrypcyjnego z motywem palca cynkowego

dendrymery

• wysokocząsteczkowe, silnie rozgałęzione polimery

• dobrze zdefiniowana architektura

• wyróżniają się jednorodnością i rozkładem ładunków

• PAMAM - polimery poliamidoaminowe dzięki + gr.amin. w warstwie zewnętrznej wiążą DNA

• rdzeń - amoniak NH4+

• NH4+ umożliwia łapanie kw. nukleinowych (-)

dendrymery składają się z

• szeregu warstw polimerów osadzonych na rdzeniu cząsteczki

• każda warstwa to identyczne 2 składniki, tworzą się generacje powierzchniowe dendrymeru

dendrymery są

• wysokorozgałęzione

• złożone z rozgałęziających cząsteczek

• mają wewnętrzne wolne przestrzenie

• rdzeń

• struktura globularna

• blisko upakowane grupy powierzchniowe

polimery

• naturalne lub syntetyczne polimery - chitozan, polietylenoiminy

• polietylenoiminy - liniowe lub rozgałęzione

zalety i wady polietyloimin PEI

• tworzenie kompleksów z DNA w którym wypadkowy ładunek jest bliski obojętnemu = lepsza dostępność

• efektywniejsze działanie endosomolityczne = efekt gąbki protonowej

• w połączeniu z liposomami stanowią ich ochronę przed opsoninami osocza

• są słabo rozpuszczalne w wodzie

kopolimery

polimery złożone z wielu różnych podjednostek

• kopolimer zawierający PEG jest stabilny, nie ulega agregacji, nie reaguje z białkami osocza

przykłady kopolimerów

• PEG-PEI = zmniejsza 10x toksyczność PEI

• PEG-polilizyna

• PEG-poliamidoaminy

• PEG-polihistydyna

• PHLP polihydroksyprolina - biodegradowalna, niska toksyczność

nowe możliwości kopolimerów

• wydłużone uwalnianie DNA

• lepsza ochrona w trakcie transportu do komórki

• biodegradowalność

• regulacja specyficzności - poszerzenie/zmniejszenie

obecnie udoskonalane nośniki niewirusowe

są połączeniem wielu różnych związków, mogą łączyć w sobie elementy każdej z wymienionych metod chemicznych np. liposomy z polimerami

nowe nośniki niewirusowe będą miały budowę złożoną z domen funkcjonalnych

• domena kondensująca DNA

• domena transdukcyjna

• domena endosumolityczna/fuzogenna

• domena translokacji jądrowej

• domena swoistości transkrypcyjnej

domena kondensująca DNA

związki kationowe kompleksujące DNA, kondensujące i ochraniające

domena transdukcyjna

ligandy receptorów komórkowych sprzężone z rdzeniem nośnika - lipid/polimer

domena endosumolityczna/fuzogenna

• wybrane lipidy

• syntetyczne peptydy

• PEI

• (2 funkcje domen)

domena swoistości transkrypcyjnej

odpowiednio dobrany promotor

losy nośnika in-vivo

w obecności osocza kompleksy o ładunku + mają utrudniony dostęp do tkanek docelowych

• agregacja kompleksów we krwi

• ładunek + odpowiedzialny za niespecyficzne oddziaływanie z ECM, powierzchnią komórek, białkami osocza

• opłaszczenie kompleksów przez opsoniny i eliminacja w wyniku fagocytozy przez kom. żerne w wątrobie i śledzionie

• aktywacja układu dopełniacza, eliminacja nośników

ilość wprowadzanego DNA plazmidowego metodą lipopleksów wynosi

2000-10000 cz. na komórkę

• 1-10% trafia do jądra kom. = proces zależny od typu kom. i stanu fizjologicznego

• transport DNA do jądra mało wydajny

degradację DNA plazmidowego przy wprowadzaniu metodą lipopleksów powodują

• lizosomy

• nukleazy cytoplazmatyczne

• szacowany okres T ½ DNA plazmidowego w cytozolu wynosi najwyżej kilka h

kolejnym krokiem po endocytozie są procesy

• endosomolizy

• fuzji z lizosomem = aktywacji enzymów litycznych

ochrona przed degradacją w endosomach i działaniem cytozolu

• chloroquine

• ominięcie przedziału endosomalnego

• PEG

• nuclear targeting

chloroquine

podnosi pH w endosomach

ominięcie przedziału endosomalnego

podjednostki toksyn Diptheria i Pseudomonas

PEG stabilizuje plazmidowe

DNA i chroni przed degradacją przez nukleazy

• ogranicza rozpoznanie przez układ immunologiczny

nuclear targeting

• bierne przechodzenie plazmidu do jądra podczas podziału komórki

• PEI - syntetyczny polimer chroni DNA w cytoplazmie, ułatwia wchodzenie do jądra

• wirusowe sygnały lokalizacji jądrowej NLS

związanie nośnika z powierzchnią komórki za pomocą

• endocytoza - zależna od klatryny

• makropinocytoza - tratwy lipidowe (niezależna od klatryny)

• kaweole - zawierają kaweoliny białka listka wewnętrznego błony; jak tratwy (niezależne od klatryny)

związanie z powierzchnią komórki wiąże się z

• blokowanie powstawania endosomów poprzez wpływ na białka odkształcające strukturę błony np. cytochalazyna D

• blokowanie przesuawania endosomów po białkach kurczliwych cytoszkieletu (lub będą uciekały z endosomów dzięki
  - cytochalazynie D
  - amyloridowi
  - nokodazolowi
  - lantrunkulinie

Lantrunkulina

toksyna produkowana przez gąbki, hamuje polimeryzację mikrotubul