chương 2 tạo dòng

Quy trình tạo dòng

- Chọn và xử lý vector
- Xử lý DNA cần tạo dòng
- Tạo vector tái tổ hợp
- Chuyển vector tth vào tế bào chủ
- Phát hiện dòng cần tìm trong thư viên gen

Các công cụ tạo dòng 6

• Restriction éndonuclease cắt

• DNA ligase nối

• Host cell

• Công cụ chuyển vector vào vật chủ

• Công cụ giữ dna trong host cell

• Công cụ xem tb nào đc tạo dòng thành công

Các loại e sử dụng trong tạo dòng 3

• Reistriction endonuclease

• Ligase

• DNA polymerase (khuếch đại→ tag và pfu ok hơn

Công dụng enzyme cắt RE

• Cắt vector

• cắt DNA

Nguồn gốc RE

ở trong các con vk ( chỉ có ở prokaryote ko có ở eukaryote)

Có enzyme endonuclease

Cách enzyme RE hoạt động

Nó chỉ cắt DNA ngoại lai không cắt dna của mk vì nó hoạt động cùng hệ thống methylase( enzyme thêm nhóm methyl lên nucleotide chuyên biệt lên trình tự nhận biết→ ngăn sự nhận bt cuẩ RE)

Đặc điểm của RE

Mỗi RE chỉ có vùng nhận biết nhất đinhk từ 4,6,8 nu gọi là PALINDROM có trình tự đối xứng đảo ngược

GAATTC
CTTAAG
➢ Các đầu dính còn gọi là đầu lồi hay đầu so le
➢ Các đầu bằng còn gọi là đầu thô
Lồi bền hơn bằng

Nhiệt độ tối ưu và nhiệt độ bảo quản e RE

37 bảo quản -20

Kiểm tra xem RE cắt có hiệu quả không

Dùng điện di gel argarose

Thứ tự bỏ các dung dịch trong phản ứng căt = e RE

Nước→ đệm → dna mục tiêu→ e cắt

Các lưu ý khi thực hiện phản ứng chèn

• 2 đoạn chèn/ 1 vector

• Đoạn chèn >= 50ng

• vector 4-5kb>= 100ng

Các cách để xem chèn có hiệu quả không

1. Kiểm tra bằn,g "Cắt giới hạn" (Restriction Analysis)

Sau khi thực hiện phản ứng nối (ligation) và biến nạp vào vi khuẩn bạn tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc (colony) nghi ngờ rồi dùng chính enzyme cắt hạn chế ban đầu để cắt lại.

• Kết quả thành công: Bạn sẽ thấy xuất hiện 2 vạch trên gel điện di: một vạch lớn là Vector và một vạch nhỏ chính là đoạn Insert.

• Kết quả thất bại: Chỉ thấy 1 vạch duy nhất của Vector (do vector tự đóng vòng mà không chèn gene vào).

2. Sử dụng Colony PCR (Nhanh nhất)

Thay vì tách chiết plasmid mất thời gian, bạn có thể dùng trực tiếp khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch làm khuôn cho phản ứng PCR.

• Bạn thiết kế cặp mồi (primers) đặc hiệu cho đoạn DNA mục tiêu.

• Chạy điện di sản phẩm PCR: Nếu thấy vạch DNA hiện lên đúng kích thước của gene mục tiêu, nghĩa là vi khuẩn đó đang mang plasmid có chứa gene bạn cần.

3. Chọn lọc Xanh/Trắng (Blue-White Screening)

4. Giải trình tự DNA (DNA Sequencing) - Chắc chắn 100%

Đây là bước cuối cùng và quan trọng nhất để khẳng định kết quả.

• Bạn gửi mẫu plasmid đi giải trình tự (thường là phương pháp Sanger)

5. Kiểm tra biểu hiện Protein (Western Blot hoặc đo hoạt tính).

• Sau khi khẳng định gene đã nằm trong vector, bạn cho vi khuẩn sinh trưởng và cảm ứng để sản xuất protein.

• Nếu bạn thu được protein có kích thước và hoạt tính mong muốn (ví dụ như insulin có tác dụng hạ đường huyết hoặc enzyme làm tan cục máu đông), đó là bằng chứng thực tế nhất cho thấy gene mục tiêu đã được chèn và hoạt động tốt.

Cách biến nạp protein vào vật chủ

Điện biến nạp ( VK cao nhất)

Hóa biến nạp

Nguyên lý của điện biến nạp

Sử dụng xung điện tạo lỗ tạm thời trên màng tế bào giúp nu xuyên qua

DNA + tb chủ đc bỏ vào cuvet có dung dịch dẫn điện ( muối có ion ) sau đó đc xung điện tại giá trị hiệu điện thế nhất định chạy qua vài s dến vài ml giây→ lớp màng kép phospholipid hình thành lỗ→ cho protein xuyên qua

Cách làm điện biến nạp

Chuẩn bị canh trường pha log→ thu lấy dịch huyền phù→ ủ trên đá → ly tâm→ tái huyền phù→ sử dụng ngay cho plasmid vào→ điện biến nạp→ cho vào mt lb nuôi 1 đêm→ cho vào mt ln có chứa ksinh

Các thông số quan trọng của điện biến nạp

Loại vk+ tần số biến nạp

Thể tích thích hợp để điện biến nạp

30ul ( 10^10 tb/ml)+5ng plasmid

Hiệu suất biến nạp điện biến nạp

hiệu quả nhất là VK, 10^9 đối vs plasmid siêu xoắn, 10^8 đối với plasmid trong phản ứng

Nhược ddireemr của điện biến nạp

Tb đắt, yêu cầu nd muối thấp

Xung điện qua mạnh chết tb

Hóa biến nạp

Sd ca2+ vì

• nó có khả năng tạo lỗ

• gắn DNA lên màng

• che - của DNA

Cách làm

ủ dna+ plasmid trong dung dịch cacl2 bể nhiệt 42 độ 60 giây→ đặt vào đá

Hiệu suất của hóa biến nạp

10^4→ 10^6

Sàng lọc thể biến nạp (phân biệt giữa thể tái tổ hợp và tái tạo lại dòng( plasmid tự nối lại )

• khử hoạt tính bằng chèn đoạn

• Tạo dòng định hướng

• Food grade maker

Khử hoạt tính bằng chèn đoạn

. Nguyên lý hóa học (Hình bên trái)

• X-gal: Là một cơ chất không màu (tương tự đường lactose).

• Enzyme $\beta$-galactosidase: Nếu enzyme này tồn tại, nó sẽ cắt X-gal thành Galactose và Indoxyl.

• Kết tủa màu xanh: Hợp chất Indoxyl sau đó bị oxy hóa và nhị trùng hóa (kết hợp đôi) tạo thành một chất có màu xanh đậm và không tan.

Kết luận: Có enzyme → Có màu xanh. Không có enzyme →Màu trắng nguyên thủy của khuẩn lạc.

2. Cơ chế sinh học phân tử (Hình bên phải)

Sơ đồ này giải thích tại sao gene mục tiêu lại quyết định màu sắc của vi khuẩn:

• Vector ban đầu: Có chứa gene lacZ (quy định tổng hợp enzyme $\beta$-galactosidase) và gene kháng kháng sinh (Amp$^r$). Lưu ý là vị trí cắt của enzyme hạn chế (như BamHI) nằm ngay giữa gene lacZ.

• Quá trình nối (Ligation):

  • Trường hợp 1 (Bên trái): Vector tự đóng vòng lại mà không nhận gene ngoại lai. Gene lacZ vẫn nguyên vẹn và hoạt động bình thường.

  • Trường hợp 2 (Bên phải): Đoạn DNA ngoại lai chèn vào đúng vị trí cắt. Việc này làm gián đoạn gene lacZ, khiến nó bị mất chức năng (không tạo ra được enzyme nữa

Tạo dòng chèn đoạn khác định hướng

• Chèn đoạn sử dụng 2 hay nhiều maker ( chỉ có 1 RE cắt).Dùng để sàng lọc và phân biệt giữa vector tự đóng vòng và vector đã nhận gene chèn.

• Định hướng sử dụng 2 hay nhiều vị trí cắt. Đảm bảo gene được chèn đúng chiều để có thể phiên mã và dịch mã tạo ra protein chính xác (đặc biệt quan trọng trong sản xuất protein tái tổ hợp).

Tạo dòng định hướng

dùng 2 RE cắt vector để tránh nói, DNA mục tiêu→ điện di agrago xem nó cắt pk ko→ dùng ligase nối lại→ nuôi mt kháng sinh

Food grade marker (tạo dòng khuyets dưỡng)

Ví dụ con đó bt ngoài tự nhiên có amino acid đó mới sốngđc

Ta đột biến nó bằng cách phá amino acid đó đi. Sau đó chèn vector có gen mục tiêu, amino acid đó vào con đó sống→ chèn đc

Vector chuyển gen là gì

Là:

• Phân tử DNA tự tái sinh

• phát triền độc lập trong tb

• Mang gen mục tiêu

Yêu cầu của vector chuyển gen 6

• có ori khoiứ đầu sao chép

• có trình tự nhận biết đơn MCS nới RE nhận biết để cắt

• có selection maker genes gen chỉ thị để dễ dàng phát hiện ra thể tái th

• size nhỏ

• promoter, vùng liên kết với ribosome

• đảm bảo di truyền bền vững của DNA tt ở dạng độc lập hay gắn vào NST của tb vật chủ

Sự khác nhau của vector tạo dòng 7

• Loại tb mà chúng có thể chuyển vào

• cách thức màng chúng xâm nhập ( biến nạp hay là xâm nhiễm)

• Kích thước đoạn gen ngoại lai mà chúng có thể mang

• vị trí cắt giới hạn chính xác của enzyme cắt hạn chế

• sự ổn định DNA khi được chèn vào

• hiệu quả tạo dòng

• số lượng bản sao

Phân loại các vector

• plasmid

• phase/ phasmid

• nhiễm sắc thể nhân tạo: BAC và YAC

Các thể hệ của plasmid

1. Tự nhiên

2. NHân tạo: pBr 322

3. thế hệ 3 có MCS, DNA ngoại lai 3-10kb

• puc

• pgem

• pbluescript

Plasmid pbr 322

plasmid nhân tạo thế hệ t2

• có ori khởi đầu sao chép→ giúp vk nhân bản

• amp và tet gen kháng kháng sinh để cho bt chỉnh xác đó là plasmid

• → cơ chế sàng lọc:

để biết gen mục tiêu chèn vào giữa tet or amp

nếu chèn vào tet thì nuôi trên mt có amp nó sống nuôi trên tet nó chết

NĐ: Phải kiểm tra bằng việc nuoi cấy vk trên 2 mt kháng sinh khác nhau đi tìm khả kl bị mất khả năng kháng lại 1 loại ks

puc19

thế hệ 3 có đủ MCS, DNA ngoại lai 3-10kb

• polylinker (mCS) đoạn dna ngắn tập hợp nhiều vị trí nhận biết nhiều loại enzyem RE

• Hệ thống sàng lọc

+LacZ

+Amp

Pemteasy

pBluescript 2 sk (+/-)

bacteriophage X vector (15-23kb)

Phage x mag gen dna đôi size 50kb có khả năng xâm nhập và phân giải vk

DNA mạch thẳng có 2 đầu cos 12nu khi nó xâm nhập vào vật chủ dùng e ligase vật chủ nối lại

làm vật chủ tiềm tan

=> nhận biết nó là đĩa vk tiềm tan( phân giải ) chứ ko phải khuẩn lạc

Vector bacteriophage chèn đoạn gen vào đâu

phage có đoạn stuffer vùng đệm không có ý ngĩa tăng sinh nên chèn gen mục tiêu vào đây (size=1/3 chiều dài phage)

Gen chèn khoảng 75-105% chiều dài phage

Ưu điểm của bacteriophage x vector

phân chia nhanh xâm nhập tốt

kích thước dna lớp hơn plasmid