OBECKA PATOLA 1-12

biopsie vs nekrospie

biopsie = odběr kusu živé tkáně pacienta
nekrospie - odebíráme od mrtvého během pitvy

co odebíráme k diagnostice

tkáně → histopatologické vyšetření, imunohistochemické
tekuté materiály →periferní krev, aspirát z KD, mozkomíšní mok → cytologické vyšetření

dělení biopsií

• otevřené

  • operační excize, resekce, amputace

• uzavřené (ambulantní)

  • endoskopická mikroexcize

  • punkční biopsie

    • jehlové biopsie - tenkojehlová aspirační - jednotlivé bb, silná jehla - vyříznutí válečku tkáně, vakuová biopsie jehlou podtlakem

    • průbojníková biopsie - používá se kruhový nůž

  • trepanobiopsie - kostní dřeň

  • kyretáž - z uteru biopsie kličkou - cervix uteri

bioptická průvodka

formulář který jde s biopsii do labu (dnes s čárovým kódem)
identifikace pacienta
charakteristiky odběru - kdy, jak, kde
klinická indikace k odběru
anamnéza

fixace vzorku

• soubor metod zabraňující autolýze vzorku

• chemická fixace 4% formaldehydu → histologické barvení (spešl i normální), imunohistochemická vyšetření, FISH

• glutaraldehyd, oxid osmičelý → elektronová mikroskopie, enzymová histochemie fyzikální

• fixace kapalný dusík → PCR, stanovení aktivity enzymu, řez ze zamražené tkáně (peroperační vyšetření)

přikrajování tkáně

po fixaci
městnání do parafínového bločku
makroskopický popis →záznam do průvodky

jak se zpracovává tkáň dále

přikrojená část v parafínu → dehydratace ethanolem → xylen → prosycení parafínem → kríjení na mikrotomech

jaké existují pitvy

• anatomická - ú. anatomie dárci, výukové/vědecké účely

• patologicko-anatomická - ú. patologie nařizuje lékař, zjištují se základní nemoci, komplikace nemocí a ověřuje se klinická dg

• zdravotní - soudně-lékařské pracoviště nařizuje lékař, zamřelí mimo zdravotní pracoviště, náhlé, neočekávané, násilné úmrtí (sebevraždy, dopravní nehody)

• soudní - soudně-lékařské pracoviště nařizována soudem/policii, smrt trestným činem

případy povinné pitvy patologicko anatomické

smrt ženypři potratu, porodu, v šestinedělí
plody u přerušených těhotenství s VVV
mrtvorozené nebo pod 18 děti
smrt při operaci
u dárců orgánů
smrt po klinických testech
nejasná příčina smrti

postup pitvy

pacient zůstává na lůžku 2 hodiny
do chladícího boxu na patologii
zevní prohlídka
vnitřní prohlídka
otevření lebeční, hrudní, břišní dutiny → prohlídka
vyjmutí orgánů
pitva orgánů
mozek a mozeček
krční orgány (jazyk, hltan, jícen, trachea, ŠŽ, příštitná tělíska
hrudní orgány (srdce, aorta, velké cévy, plíce, thymus
orgány retroperitonea (




odebírání nekroskopie
→+ vypisování pitevního protokolu

co obsahuje pitevní diagnoza

I. základní onemocnění
II. komplikace
III. příčina smrti
IV. vedlejší nálezy
epikríza

části mikroskopu

žárovka, kondenzor, objektivy, okuláry, tubus

typy pozorování v mikroskopu

diaskopické - pozorujeme objekt v procházejícím světle, světelná mikroskopie, světelné/tmavé pole

episkopické - pozorujeme objekt v odraženém světle, fluorescenční mikroskopie

rozlišovací schopnost světelného a elektronového mikroskopu

SM - dlouhá vlnová délka →do 0,1 mikrometru
EM - krátká vlnová délka → 0,1 nm (detaily organel, buněk, tkání)

typy elektronocýxh mikroskopů

skenovací SEM
Transmisní - TEM

jak funguje TEM

z elektronového děla jsou elektrony → tubus → solenoidy (EM cívky ovlivňující dráhu elektronů) → přes vzorek → projektor

kde v patologii se využívá TEM?

nefropatologie - glomerulopatie a nefropatie
myopatologie
periferní neuropatie -
vyšetření buněčných organel

příprava tkáně pro elektronový mikroskop

max 1mm3
fixace: glutaraldehyd → oxid osmičely
zalévá se do pryskyřice
krájení na ultramikrotomu
přesunutí na měděné mřížky

postup přípravy histologického barvení

tkáňové řezy přeneseme na sklíčko
odstraníme parafín (xylenem)
zavodníme tkáň a odstraníme xylen →sestupná alkoholová řada
barvíme (hematoxylin-eosinem)
odvidnění řezu (rostoucí alkoholová koncentrace)
montování řezu → podložní sklíčko + řez + krycí sklíčko

jak se co barví u HE

hematoxylinem → modro/fialový, basofilní struktury (jádra, ribosomy)
eosinem → růžově, eosinofilní struktury (proteiny v cytoplazmě ECM)

barvení pro odlišení eosinofilního materiálu (7)

Massonovy trichromy → kolegen

van Giesen →kolagen a fibrin

orcein →elastická vlákna

impregnace dle Gomoriho → retikulární vlákna

Koňžská červeň → amyloid

Bestův karmín → glykogen

gmelinoa reakce → bilirubin

klasická histochemie

spojuje morfologii buňky a výskyt chemické látky

PAS reakce → polysacharidy, glykogen, glykokonjugáty

Pearls → hemosiderin

Sudanova čerň → lipidy

enzymová histochemie

aktivita enzymu v zamražené tkáni (formalin by enzym zničil)
enzymový substrát, který při aktivitě daného enzymu změní barvu (!!musí být optimál pH)
myopatie, diferenciace bílých krvinek, celiakální sprue

kdy se využívá imunohistochemie

u nádorových onemocnění s nízce diferenciovanými až anaplastickými nádorovými bb
např lymfomy →Bly(CD20+) Tly(CD3+)

cytologie definice

=posuzování cytologie bb na podložním skle

typy odběru pro cytologii

exfoliativní cytologie
fine needle aspiration cytology
tělní tekutiny

efoliativní cytologie

stěry/otisky
sliznice
např. cytologie v tenké vrstvě - stěr je vypláchnutý v tekutém mediu → transport do labiny

fine needle aspiration cytology

pokud je daný materiál blízko kůže (ŠŽ, mamma, LU, KD)
např. biopsie mediastinálních LU na slepo/ s UZ

metody zpracování tělních tekutin pro cytologii

cytospin - centrifuga → odstředivka, odsátí tekutiny papírem

cytobloky - centrigugát tekutin → přidáme plazmu a trombin → vychytání do vzniklé sraženiny → fixace formolem

cytosedimentační metoda → mozkomíšnímok

výhody cytologie

málo zátěže na pacienta, méně invazivní
ambulantně
rychlejši a jednodušší

nevýhody cytologie

pouze bb, nelze posoudit architektoniku tkání

mikroexcize

endoskopická mikroexcize = typ uzavřené biopsi

Buněčná adaptace (princip)

Schopnost buňky reagovat na měnící se nároky a nastolit nový rovnovážný stav (např. hypertrofie, atrofie).

Reverzibilní poškození buňky

Stav, kdy poškození nepřekročilo hranici a buňka je schopna se po odeznění stimulu vrátit k normálu.

• snížená generace ATP

• snížená aktivita Na/K ATPázy

• zvášené IC kalium

• ER stres

• zvýšená permeabilita buňky

Následky deplece ATP (reverzibilní)

Hromadění laktátu (pokles pH), selhání Na/K ATPázy (otok), zvýšení intracelulárního vápníku a ER stres.

Střádání metabolitů (příklady)

Důsledek neschopnosti buňky metabolizovat substráty: steatóza (tuky), glykogenóza, cholestáza.

Bod návratu (point of no return)

Hranice poškození, po jejímž překročení dochází ke zhroucení funkcí a neodvratné buněčné smrti.

Ireverzibilní poškození buňky

Konečné stadium poškození charakterizované ztrátou integrity membrán a buněčnou smrtí. → překročen point of no return

Hypoxie a ischemie (rozdíl)

Hypoxie je nedostatek kyslíku; ischemie je zastavení přítoku krve (těžší, chybí i živiny a odsun zplodin).

u obou je ale porušena oxidativní fosforylace →deplece ATP

Hlavní příčiny poškození buňky

Hypoxie, fyzikální vlivy (záření, teplota), chemické látky (toxiny), genetické vady a imunologické reakce, nutriční nerovnováha

Vápník v poškození buňky

Zvýšení hladiny Ca2+ v cytosolu aktivuje lytické enzymy (ATPázy, fosfolipázy, proteázy, endonukleázy).

Fyzikální příčiny poškození

UV a ionizující záření, mechanické trauma, změny teploty, atmosférický tlak a elektrická energie.

Nutriční nerovnováha (vztah k buňce)

Nedostatek (deficit vitaminů) i nadbytek (obezita, intoxikace glukózou) vedou k poškození buněčného metabolismu.

jaké jsu metabolické cesty vedoucí k poškození buňky

deplece ATP

porucha kalciové bb

volné radikály

poruchy membránové permeability

Deplece ATP (příčiny a hranice a následky)

Důsledek ischemie či toxinů; pokles pod 5–10 % fyziologické hodnoty vyvolává kritické poškození.

následky

• hromadění produktů anaerobní glykolýzy

• snížená NaK ATPáza

• zvýšené Ca2+

• stres ER

Následky selhání Na/K-ATPázy

Eflux draslíku, influx sodíku a vody do buňky -> rozvoj intracelulárního edému.

Následky anaerobní glykolýzy

Hromadění laktátu, pokles pH (acidóza) a zvýšení osmotického tlaku v buňce.

ER stres a UPR (Unfolded Protein Response)

Hromadění chybně složených proteinů v ER; vede k dilataci ER, odpojení ribosomů a zastavení proteosyntézy.

Vápníková homeostáza (udržování)

Zajištěna 3Na+/Ca2+ výměníkem a Ca2+-ATPázou na plazmatické membráně a v retikulu.

Toxické účinky zvýšeného cytosolu Ca2+

Aktivace destruktivních enzymů: ATPázy, fosfolipázy, proteázy a endonukleázy (DNA-ázy).

Volné radikály (definice)

Extrémně reaktivní částice s nepárovým elektronem (superoxid, peroxid vodíku, hydroxyl, oxid dusnatý).

Lipoperoxidace PUFA a cholesterolu

Reakce radikálů s tuky v membránách; vznikají hydroperoxidy a malondialdehyd (poškozuje DNA/proteiny).

Oxidace proteinů radikály

Vede k tvorbě nežádoucích příčných vazeb mezi řetězci nebo k jejich přímé fragmentaci.

Poškození DNA volnými radikály

Přeměna guaninu na 8-oxoguanin a vznik zlomů v řetězcích (SSB a DSB).

co všechno můžou poškozovat volné radikály

PUFA a cholesterol → neenzymová lipoperoxidace

oxidace proteinů

DNA

antioxidační systémy

enzymy - superoxiddismutáza, kataláza, glutathionperoxidáza

proteiny vázající kovy - transferin, feritin, ceruloplazmin

nízkomolekulární antioxidanty

Nízkomolekulární antioxidanty

Tokoferol (E), urát, askorbát (C), glutathion, flavonoidy, karotenoidy a nekonjugovaný bilirubin.

Porucha membránové permeability

Zlomový bod k ireverzibilnímu poškození; způsobena radikály, deplecí ATP, viry, toxiny či komplementem.

Buněčná smrt (úrovně)

Může postihovat jednotlivé buňky (apoptóza), skupiny buněk nebo celé tkáňové celky a orgány (nekróza).

Nekróza (charakteristika)

Vždy patologická; spojená s rozpadem membrán, vylitím obsahu do okolí a následným zánětem.

Apoptóza (charakteristika)

Programovaná smrt; fyziologická i patologická; buňka se scvrkává, membrány zůstávají celistvé, nevzniká zánět.

Nekroptóza

"Programovaná nekróza"; kombinuje mechanismy apoptózy (regulace) s morfologií nekrózy (rozpad membrán).

v růstové chrupavce, při steatohepatitidě nebo jako obrana proti virům, které blokují kaspázy.

Pyroptóza

Zánětlivá forma programované smrti; aktivována kaspázou-1, vede k uvolnění prozánětlivých cytokinů (IL-1).

Ferroptóza

Forma smrti závislá na železe; dochází k masivní lipoperoxidaci membrán vlivem oxidačního stresu.

Apoptotická tělíska

Fragmenty buňky obalené membránou, které jsou rychle a tiše pohlceny makrofágy bez reakce okolí.

Apoptóza (definice)

Programovaná buněčná smrt; aktivní proces vyžadující energii (ATP), který probíhá bez zánětlivé reakce

→ kordinovaná aktivace enzymu se zachovalou buněčnou membránou

Morfologie apoptózy

Zahuštění cytoplazmy, kondenzace chromatinu a rozpad na apoptotická tělíska (tzv. blebs) → fagocytoza makrofágy

Fyziologická apoptóza (příklady)

Obnova epitelu střeva, selekce lymfocytů v uzlinách, zánik endometria v cyklu nebo embryogeneze, krvetvorba

vždy musí být v rovnováze s obnovou tkáně

kdy je patologicky indukovaná apoptoza

• ztráta působení RF - lymfocyty, hormonálně dependentí bb

• poškození DNA

• stres ER

• infekce

Numerická atrofie (souvislost s apoptozoz)

Stav, kdy apoptóza převažuje nad obnovou buněk, což vede ke zmenšení počtu buněk v tkáni.

P53 a poškození DNA

Genotoxický stres aktivuje p53, který zastaví cyklus v G1 fázi nebo indukuje apoptózu.

Proapoptotické proteiny

Proteiny BAX, BAK a skupina BH3-only; klíčové efektory spouštějící apoptotickou kaskádu.

ER stres a apoptóza

Hromadění nesprávně složených proteinů (UPR) vede k apoptóze; význam u Alzheimerovy a CJD choroby.

Lymfocyty a cytokiny

Lymfocyty jsou závislé na přísunu cytokinů; ztráta těchto růstových faktorů indukuje jejich apoptózu.

Apoptóza u infekcí

Uplatňuje se při eliminaci virem napadených buněk (např. u AIDS nebo virových hepatitid).

Neurodegenerace a apoptóza

Patologická indukce apoptózy hraje roli u Parkinsonovy choroby, ALS nebo myelodysplastického syndromu.

Vnější cesta apoptózy (spouštěč)

Interakce ligandů smrti (např. FasL na T-lymfocytech) s receptory smrti (např. FasR) na povrchu buňky → trimerizace FasR → navázání FADD z vnitřní strany → aktivace iniciačních kaspáz 8,10 → exekuční kaspázy 3,6,7 nebo Bid protein (posílení vnitřní cesty)

FADD (Fas-associated death domain)

Adaptorový protein, který se váže na trimerizovaný Fas receptor a aktivuje iniciační kaspázy 8 a 10.

Iniciační kaspázy vnější cesty

Kaspázy 8 a 10; aktivují exekuční kaspázy nebo protein Bid (propojení s vnitřní cestou).

Vnitřní cesta apoptózy (spouštěč)

Vnitřní stres (poškození DNA, hypoxie, ER stres) vedoucí k uvolnění cytochromu C z mitochondrií → vazba cc na protein Apaf → vazba Apaf na prokaspázu 9 → APOPTOZOM → aktivace iniciační kapsázy 9 → aktivace kaspáz 3, 6,7

Apoptozom (složení a funkce)

Komplex cytochromu C, proteinu Apaf-1 a prokaspázy 9; aktivuje iniciační kaspázu 9.

Bax a Bak (funkce)

Pro-apoptotické proteiny, které tvoří kanály v zevní mitochondriální membráně pro únik cytochromu C.

uvolnují se z mezimembránového prosoru

Bcl-2 a Bcl-X (funkce)

Anti-apoptotické proteiny, které blokují aktivitu Bax a Bak a chrání integritu mitochondrií.

BH3-only proteiny (regulátory)

Senzory stresu; při poškození buňky vyvazují Bcl-2, čímž uvolňují cestu pro pro-apoptotické signály.

Exekuční kaspázy (3, 6, 7)

Konečné proteázy, které štěpí strukturní proteiny buňky a aktivují DNázy k fragmentaci DNA.

signály pro makrofágy z apoptické bb

Find me - Látky jako lysolecitin (lysofosfatidylcholin), které lákají makrofágy k apoptotické buňce.

Eat me - Fosfatidylserin; v normální buňce je uvnitř, u apoptózy se "překlopí" vně, což je signál k pohlcení.

Anoikis

Zvláštní forma apoptózy vyvolaná ztrátou kontaktu buňky s extracelulární matrix (přes integriny).

Rezistence k anoikis

Vlastnost nádorových buněk přežít i po odtržení od původní tkáně, což je klíčové pro vznik metastáz.

definice nekrozy

intravitální odumření tkáně/orgánů

nejzávažnější regresivní změna po překročení kompenzatorních mechanismů buňky

pasivní proces (netřeba ATP)

vždy se zánětem

vznik nekrozy

náhle → hned ireverzibilní

pomalu → reverzebilní → irreverzibilní

reverzibilní fáze

snížená oxidativní fosforylace → hromadění metabolitů anaerobní glykolýzy (laktémie, vysoký osmotický tlak, nízké pH), snížení NaK ATPáza, zvýšené IC Ca, ER stres, zvýšená permeabilita bb

střádání metabolitů (steatoza, glykogenoza, cholestáza)

irreverzibilní fáze

ztráta integrity membránových systémů tzn buněk i organel

Biochemické znaky nekrózy

Únik enzymů do krve (minuty až hodiny): ALT/AST (jaterní buňky), Troponin/CK (myokard), LDH.

Reverzibilní mikroskopické změny

Hydropická dystrofie (otok), vakuoly (dilatované ER), hromadění látek (steatóza, glykogenóza).

Pyknóza (jádro)

Ireverzibilní kondenzace chromatinu; jádro se zmenšuje a tmavne.

Karyorrhexe (jádro)

Fragmentace pyknotického jádra na nepravidelné hrudky ("rozpad jádra").

Karyolýza (jádro)

Rozpouštění chromatinu endonukleázami; jádro bledne a postupně mizí.

Hypereozinofilie cytoplazmy

Nekrotická cytoplazma se barví více doruda (eozinem) kvůli ztrátě RNA a denaturaci proteinů.

Demarkační lem

Zóna zánětu (překrvení, makrofágy, granulocyty) ohraničující nekrotickou tkáň od zdravé.

Kalné zduření (makroskopie)

Orgán je světlý, tužší a těžší; důsledek hydropické dystrofie (reverzibilní fáze).