Les 3

Rond week 4 van de embryonale ontwikkeling.

wanneer ontstaan PGCs?

epiblast

waaruit ontstaat PGC?

Proliferatie en migratie naar de gonaden.

wat volgt er na het vormen van PGCs?

Omdat het uitgebreide epigenetische reprogramming vereist (o.a. DNA demethylatie en chromatin changes).

wat maakt het vormen van PGCs zo complex?

Blimp1

Prdm14

vroege PGC markers

Een oppervlaktemarker gebruikt om PGCs te identificeren/isoleren.

wat is c-KIT in de context van PGCs?

Naïve PSCs → EpiLCs → PGCLCs → maturatie → gameten.

ontwikkelingsroute om functional germ cells te maken van ESCs / iPSCs in muizen

Activin A en bFGF (met KSR).

welke signalen induceren EpiLCs?

BMP-signalen.

welke signalen induceren PGCLCs?

Omdat naïeve ESCs/iPSCs eerst naar epiblast-like cells (EpiLCs) moesten worden gebracht, een ontwikkelingsstaat die competent is om PGCLCs te vormen.

nood priming step voor PGC-inductie

This handicap of the experiment was that an in vivo environment was still needed.

handicap van de 2011/2012 experiment

Culture the PGCLCs with a somatic niche.

Testes from an early postnatal mouse were taken, and a somatic testicular cell suspension was made to support further maturation of the germ cells.

Additional factors and hormones were added during the timeline

volledige in vitro oplossing van Zhou et al.

Naïeve PSCs → EpiLCs → PGCLCs → primaire oocyte → GV oocyte → MII oocyte.

welke route volgden de cellen in Hikabe et al. voor in vitro productie van funcitonele oocyten uit mESCs / iPSCs?

Fetal gonadal somatic cells

• Somatische cellen uit de foetale gonade/ovary

• Vormen de ondersteunende niche voor PGCLCs
  → geven signalen die nodig zijn voor verdere oocytontwikkeling

• Cruciaal in Hikabe et al. 2016
  → maakte volledige in vitro oocytvorming uit mESCs/iPSCs mogelijk

Principe: PGCLCs kunnen niet vanzelf uitgroeien tot functionele oocyten; ze hebben een foetale gonadale niche nodig die de juiste maturatiesignalen geeft.

somatische niche cruciaal voor in vitro productie van functionele oocyten uit mESCs/iPSCs.

Nee, veel lager dan in vivo.

efficientie in vitro productie van functionele oocyten uit mESCs/iPSCs vs echte

veel meiotische fouten zoals asynapsis en abnormale chromosoomsegregatie

kwaliteitsproblemen bij in vitro productie van functionele oocyten uit mESCs/iPSCs.

Germinal vesicle oocyte; immature oocyte vóór meiotische maturatie.

GV oocyte

Metaphase II oocyte; mature eicel klaar voor fertilisatie.

MII oocyte

SCD Oocytes gave rise to mESC which could form SCD oocytes again!

belangrijke observatie bij in vitro productie van functionele oocyten uit mESCs/iPSCs.

Derivation of hESC in presence of Activin A promotes human PGC-like development

welke factor zorgt voor betere PGC-like development van hESC?

Het rechtstreeks omzetten van een somatische cel naar een ander celtype zonder pluripotente tussenstap.

transdifferentiation

VASA

voorbeeld belangrijke factor voor direct reprogramming naar germ cell-like cells

Human primordial germ cell-like cell; in vitro gemaakte humane PGC-achtige cel.

hPGCLC

SOX17

key regulator of hPGCLC / a critical specifier of Human Primordial Germ Cell fate

• Primed hiPSCs kunnen hPGCLCs vormen

• Dit gebeurt via een incipient mesoderm-like state
  → een vroege mesoderm-achtige tussenfase

• Daarna worden de cellen richting germ cell fate gestuurd
  → vorming van hPGCLCs

Principe: humane PGC-like cells kunnen uit primed hiPSCs ontstaan via een vroege mesoderm-achtige tussenstap.

Via welk tussenstadium ontstaan hPGCLCs uit primed hiPSCs?

Het stabiliseert germline transcriptie en remt somatische/neuronale differentiatie.

Wat doet BLIMP1 in humane PGC-inductie?

Humane PGCLCs tonen minder volledige DNA demethylatie.

Onvolledige reprogramming kan leiden tot lagere kwaliteit en maturatieproblemen.

Hoe verschilt humane PGCLC reprogramming van muis?

SCNT (somatic cell nuclear transfer).

Welke reprogrammingstrategie wordt als mogelijk beter/veiliger genoemd voor gametenvorming?

Naïeve mESCs.

Vanuit welke startpopulatie werd in muizen het grootste succes bereikt voor gametenvorming?

Welke startpopulatie optimaal is (naïef of primed, en welke naïeve conditie).

Welke open vraag blijft bestaan voor humane gametenvorming uit stamcellen?

Omdat moleculaire pathways voor germ cell development verschillen tussen muis en mens.

Waarom moet men voorzichtig zijn met muisdata vertalen naar mens?

SOX17

Welke factor wordt genoemd als voorbeeld van speciesverschil in germ cell development?

Genetische en epigenetische afwijkingen moeten uitgesloten worden vóór klinisch gebruik.

Waarom is veiligheidsanalyse van stemcel-afgeleide gameten noodzakelijk?

Omdat manipulatie van menselijke voortplanting en kiemlijn belangrijke ethische implicaties heeft.

Waarom zijn ethische reflecties noodzakelijk bij stemcel-afgeleide gameten?

Nee, het is nog te vroeg om conclusies te trekken.

Zijn klinische toepassingen momenteel al klaar?

• Start met een lege MII-oöcyt
  → eigen DNA van de eicel is verwijderd

• Breng een somatische nucleus in
  → nucleus is normaal diploïd, dus 2n

• Oöcytcytoplasma probeert de chromosomen te herorganiseren
  → vorming van een meiotic-like spindle

• Doel: reductie van 2n naar 1n
  → kunstmatige “meiose-achtige” haploidisatie

• Daarna kan bevruchting met een spermacel gebeuren
  → vorming van een zygote

Principe: men probeert een gewone lichaamscel genetisch te halveren zodat die als gamete-achtige bijdrage kan functioneren.

somatic cell haploidization

RA

Fa

RS-1

Sc

(RAFA, RSSC)

factoren in medium voor Somatic cell haploidization

Chromosome segregation totally not working in humans

werkt Somatic cell haploidization in de mens?

Door onbeperkte proliferatie en mogelijkheid tot differentiatie naar veel celtypes.

Waarom zijn pluripotente stamcellen interessant voor therapie?

Lokale toediening en relatief toegankelijke weefsels.

Waarom zijn oogziekten vaak een aantrekkelijk doelwit voor pluripotente stamcellen toe te passen?

Teratoma formation door resterende ongedifferentieerde cellen.

Wat is een belangrijk veiligheidsrisico van pluripotente stamcellen?

Efficiënte delivery naar het juiste weefsel.

Wat is een belangrijke praktische uitdaging bij celtherapie?

Door immunologische afstoting.

Waarom kunnen grafts (het stuk weefsel of de cellen die je transplanteert in een patiënt) falen ondanks goede cellen?

Phase I: safety

Phase II: proof of concept

principe phase I en II clinical trials

Ze kunnen remyelination bevorderen en axonen ondersteunen.

Waarom zijn oligodendrocyte precursor cells interessant bij spinal cord injury?

Age-related macular degeneration (AMD): Progressive loss of retinal epithelium monolayer from the macula → damage to photoreceptors

Stargardt disease: Mutations leading to loss of retinal pigmented epithelium (RPE), eventually causing blindness at young age

Myopic macular degeneration: Atrophy and cracks in sub retinal area

belangrijke oogziekten

The eye is easy accessible and less immunosuppressive.

voordeel behandelen oog met PSCs

iPSCs, but allogeneic approaches keep dominating

Sinds 2018, welke methode is het meest dominant in klinische studies?

Cellen afkomstig van een donor en gebruikt voor andere patiënten

betekenis allogeneic approaches

observe a lack of standardization and transparency about the PSCs lines used, characterization of the PSC-derived cells, and the preclinical models and assays applied to show efficacy and safety.

probleem met iPSCs in clinical studies

eye, central nervous system (CNS), and cancer

hoofdtoepassingen van interventional clinical trials met hPSCs vandaag te dag

Allogene human induced pluripotent stem cells: donor-afgeleide iPSCs gebruikt voor andere patiënten.

hiPSC-allo

diabetes, epilepsy, PD, and AMD.

voor welke ziekten lijken er goede resultaten te zijn voor PSC-derived products?

Trophectoderm: outer layer of the blastocyst, will form the placenta.

Hypoblast = primitive endoderm: cells that will form extra-embryonic tissues.

Epiblast: cells that will form the real embryo.

van welke delen van een muis embryo komen stem cells?

hypoblast

van welk deel van de blastocyst kunnen we bij muizen wel, maar niet bij de mens, stamcellen maken?

Expanded and extended stem cells (are more powerful, since closer to totipotent), are possible to make in mice and human

Expanded / extended: more potency, ‘expanded’ in comparison to standard pluripotency

expanded en extended stem cells

Omdat ze kunnen bijdragen aan zowel embryonale als extra-embryonale lijnages.

waarom worden extended pluripotent stem cells (EPS cells) gezien als totipotent-like?

EPS cells could be efficiently derived from early embryos and through reprogramming,

vanwaar kan je extended pluripotent stem cells (EPS cells) krijgen?

Een blastocyst-like structuur gemaakt uit stamcellen.

blastoid

Mouse ESCs en mouse T (trophoblast) SCs.

welke cellen werden gebruikt bij de blastoid studie?

• Lijken qua grootte en celaantal op een mid-stage blastocyst

• ICM-achtige cellen aanwezig
  → OCT4+ en NANOG+

• Trophectoderm-achtige cellen aanwezig
  → CDX2+, maar eerst vrij laag

• Primitive endoderm-like cellen waren beperkt
  → daardoor niet volledig zoals een natuurlijke blastocyst

• Mediumsignalen konden TE-identiteit verbeteren
  → hogere CDX2-expressie

Principe: blastoids bootsen belangrijke blastocystkenmerken na, maar zijn nog geen perfecte kopie van een natuurlijk embryo.

resultaten blastoid studie

• Decidua = aangepast baarmoederslijmvlies na implantatie

• Als een embryo/blastoid probeert te implanteren, reageert het endometrium
  → dat heet decidualisatie

• Marker: Aldh3a1
  → toont dat het endometrium een implantatie-reactie vertoont

Principe: decidua is het “ontvangende” baarmoederweefsel dat ontstaat als reactie op implantatie; Aldh3a1 is een marker dat die reactie gestart is.

Decidua en marker ervan

Trophectoderm/placenta differentiatie en implantation-like activiteit.

wat tonen trophoblast giant cells aan?

TGF-beta signaling

signaalpad belangrijk bij blastocyst formation

De novo derivation of TSCs → similar (90% generate CDX2+ colonies at passage 2)

De novo derivation of ESCs → lower (35%, CDX2 negative colonies)

is het mogelijk om stem cells te krijgen van blastoids?

blastoids kunnen vroege blastocystfuncties nabootsen, maar missen vaak een goed functionerende PE-lijn, waardoor ontwikkeling na implantatie stopt.

waarom kunnen mouse blastoids niet verder ontwikkelen dan implantatie?

Een embryo model gevormd uit ESCs en TSCs dat post-implantation ontwikkeling nabootst.

ETS-embryo

artificial embryos are made from stem cells, but not fully equivalent

artificial embryo