Medische microbiologie, Inleiding

Welke micro-organismen zijn er?

Bacteriën, virussen, schimmels en gisten, algen en protozoa

Welke factoren zorgen voor een geschikte omgeving?

• C-bron, N-bron, gistextract, water, voedselbestanddelen/groeifactoren (vitaminen, mineralen…)

• pH, temperatuur, zuurstofgehalte, osmotische druk

Uit welke drie aspecten is de medische microbiologie opgebouwd?

Isolatie

• Isoleren van pathogenen, in kweek/cultuur brengen van pathogenen → verkrijgen van losliggende kolonies dmv. zuivere cultuur of reincultuur

Identificatie (via biologische classificatie die internationaal aanvaard is)

• Identificeren van de geïsoleerde pathogenen → enkel mogelijk bij reinculturen

• Macroscopisch onderzoek: uiterlijke kenmerken kolonies → grootte, pigmentatie (kleurreacties), vorm, rand, hoogte, oppervlak)

• Microscopisch onderzoek: RMO, gramkleuring → morfologie, onderlinge ligging of rangschikking

• Biochemisch onderzoek: nagaan van de biochemische eigenschappen → elk MO heeft een eigen set aan biochemische eigenschappen = biochemische vingerafdruk

Gevoeligheidsbepaling

• Bepalen van de gevoeligheid van de geïdentificeerde, geïsoleerde pathogenen

Bespreek MacConkey agar (MC, MAC). OKE

Selectief en electief

• Selectieve stoffen: galzouten en kristalviolet → remmen de groei van grampositieve bacteriën

• Groei van: gramnegatieve bacteriën

• Electieve stoffen: lactose en neutraalrood (pH-indicator) → lactosenegatieve kolonies kleuren wit/kleurloos, lactosepositieve kolonies kleuren roze-rood (zuurproductie en lagere pH zorgen voor kleurverandering) en vertonen afname/neerslag in galzouten

Bespreek Mannitol Salt Agar (MSA). OKE

Selectief en electief

• Selectieve stoffen: NaCl (hoge concentratie) → remt de groei van de meeste bacteriën, maar halotolerante bacteriën kunnen wel groeien

• Groei van: Staphylococci

• Electieve stoffen: mannitol en fenolrood (pH-indicator) → mannitolnegatieve kolonies kleuren wit/kleurloos (rode bodem), mannitolpositieve kolonies kleuren geel (zuurproductie en lagere pH zorgen voor kleurverandering) → S. aureus = mannitolpositief en S. epidermidis = mannitolnegatief

Bespreek cystine-lactose-elektrolyte-deficient (CLED) agar. OKE

Algemene bodem dat gebruikt wordt voor de isolatie van micro-organismen uit urine → semi-kwantitatieve beoordeling

Niet echt selectief, maar bevat cystine en is elektrolyt-deficiënt

• Cystine → bevordert groei van sommige bacteriën

• Lage elektrolytenconcentratie belemmert de uitzwerming van Proteus

Electieve stoffen: lactose en bromothymolblauw (pH-indicator)

• Lactosenegatieve kolonies kleuren blauw/groen

• Lactosepositieve kolonies kleuren geel (zuurproductie en lagere pH zorgen voor kleurverandering)

Bespreek gal-esculine agar. OKE

Selectief en electief → vnl. voor de isolatie van Enterococcus spp. en sommige Streptococcus spp. (groep D) (uit urine)

Selectieve stoffen: galzouten en Na-azide

• Galzouten remmen de groei van de meeste grampositieve bacteriën, buiten Enterococcus spp. en groep D Streptococcus spp.

• Na-azide remt de groei van gramnegatieve bacteriën

Electieve stoffen: esculine en ijzerzouten

• Esculinenegatieve kolonies kunnen esculine niet hydrolyseren/afbreken en vertonen geen zwartverkleuring

• Esculinepositieve kolonies kunnen esculine wel hydrolyseren/afbreken → afbraakproducten reageren met ijzerzouten → zwart precipitaat = zwartverkleuring → Enterococcus spp. en groep D Streptococcus spp.

Bespreek CPS-agar OKE

Algemene bodem dat gebruikt wordt voor de isolatie van micro-organismen uit urine → semi-kwantitatieve beoordeling én directe identificatie van E. coli, Proteus en Enterococcus, en presumptieve identificatie van KESC (beter dan CLED-agar voor de isolatie van pathogenen uit urine)

Bevat tryptofaan en chromogene substraten

E. coli

• Beta-glucuronidase (of eventueel beta-galactosidase, zoals op UriSelect agar) → roze-bordeaux kolonies

Proteus, Morganella, Providencia

• Tryptofaandeaminase → bruinverkleuring

• Extra: indoltest → negatief = P. mirabilis, positief = P. vulgaris, Morganella of Providencia

Enterococcus

• Beta-glucosidase → turquoise kolonies (grampositieve kokken)

KESC

• Beta-glucosidase → groene tot bruingroene kolonies (gramnegatieve staven)

Overige bacteriën

• Andere kleur/morfologie → minder typisch

Chocolade agar + polyvitex + VCAT OKE

Chocolade agar + polyvitex + VCAT → 37°C/CO2 → kweken van veeleisende bacteriën zoals N. meningitidis

• Rijke gelyseerde bloedagar (voedingstoffen)

• Aangerijkt met factor X (hemin) en V (NAD) = essentiële groeifactoren voor bepaalde bacteriën

• Polyvitex = extra vitamines en groeifactoren → betere groei van fastidieuze kiemen

• Selectiviteit door antibioticamengsel VCAT = vancomycine (tegen grampositieven), colistine (tegen gramnegatieven), amfotericine (tegen schimmels), trimethoprim (tegen contaminanten)

Bespreek de haemophilus chocolade-agar. OKE

Selectieve voedingsbodem voor de isolatie van Haemophilus spp. uit een mengflora

• Rijke gelyseerde bloedagar (voedingstoffen)

• Aangerijkt met factor X (hemin) en V (NAD) = essentiële groeifactoren voor bepaalde bacteriën

• Selectiviteit: antibiotica-mengsel: bacitracine – cloxacilline

Bespreek MRSA Select. OKE

Selectief chromogeen medium voor de isolatie en directe identificatie van methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)

• Selectiviteit: antibiotica-mengsel en hoge zoutconcentratie → remt groei van andere bacteriën, bevatten vaak meticilline (of een verwant antibioticum zoals oxacilline of cefoxitine) in het medium

• Bevat een chromogeen substraat voor de detectie van Staphylococcus aureus (β- glucosidase of β-galactosidase)

Bespreek Buffered Charcoal Yeast Extract (BCYE) agar. OKE

Rijk medium voor het kweken van fastidieuze bacteriën, vnl. Legionella pneumophila

• Buffer → pH stabiel houden voor optimale groei

• Charcoal/actieve kool → neutralisatie van toxische stoffen zoals zuurstofradicalen en vetzuren, bescherming van gevoelige bacteriën

• Yeast extract/gistextract → vitamines, aminozuren en groeifactoren

• L-cysteïne → essentieel aminozuur voor Legionella, groeit niet zonder cysteïne

• IJzerzouten → nodig voor bacterieel metabolisme

Bespreek Salmonella-Shigella-agar (SS-agar). OKE

Selectief en electief → isolatie van Salmonella enterica en Shigella uit bijvoorbeeld stoelgang

Selectieve stoffen: galzouten en kleurstoffen, waaronder briliantgroen en natriumcitraat

• Remmen de groei van grampositieve bacteriën en vele andere Enterobacteriaceae

Electieve stoffen: lactose, neutraalrood, natriumthiosulfaat en ijzerzouten

• Lactose en neutraalrood: lactosenegatieve kolonies kleuren wit/kleurloos, lactosepositieve kolonies kleuren roze-rood (zuurproductie en lagere pH zorgen voor kleurverandering)

• Natriumthiosulfaat en ijzerzouten: natriumthiosulfaat fungeert als S-bron, H2S-negatieve kolonies kunnen deze niet reduceren en produceren geen H2S, H2S-positieve kolonies wel → H2S reageert met ijzerionen (ijzerzouten) tot ijzersulfide = onoplosbaar en zwart van kleur → zwart precipitaat

Bespreek Xylose Lysine Deoxycholate agar (XLD-agar). OKE

Selectief en electief → isolatie van Salmonella enterica en Shigella uit bijvoorbeeld stoelgang

Selectieve stoffen: deoxycholate = galzout

• Remt de groei van grampositieve bacteriën

Electieve stoffen: suikers (xylose, lactose, sucrose), fenolrood, lysine, natriumthiosulfaat en ijzerzouten

• Suikers (xylose, lactose, sucrose) en fenolrood: niet-suikerfermenterende kolonies kleuren rood, suikerfermenterende kolonies kleuren geel (zuurproductie en lagere pH zorgen voor kleurverandering)

• Lysine: kolonies die lysinedecarboxylatie kunnen uitvoeren kleuren rood (basenproductie en hogere pH zorgen voor kleurverandering) → Salmonella enterica!

• Natriumthiosulfaat en ijzerzouten: natriumthiosulfaat fungeert als S-bron, H2S-negatieve kolonies kunnen deze niet reduceren en produceren geen H2S, H2S-positieve kolonies wel → H2S reageert met ijzerionen (ijzerzouten) tot ijzersulfide = onoplosbaar en zwart van kleur → zwart precipitaat

Bespreek Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin (CIN) agar.

Selectief en electief → isolatie van Yersinia enterocolitica uit klinische en voedselmonsters

Selectieve stoffen: mix van antibiotica

• Remt de groei van de meeste Enterobacteriaceae en Pseudomonas spp.

• Cefsulodin → antibioticum dat specifiek de groei van gramnegatieve bacteriën remt, irgasan (triclosan) → breedspectrum antimicrobieel middel dat de groei van begeleidende flora remt, novobiocin → antibioticum dat grampositieve en sommige gramnegatieve bacteriën remt

Selectieve stoffen: deoxycholate = galzout

• Remt de groei van grampositieve bacteriën

Electieve stoffen: mannitol en neutraalrood

• Mannitol en neutraalrood: mannitolnegatieve kolonies (die kunnen groeien) kleuren wit/kleurloos, mannitolpositieve kolonies kleuren dieprood (zuurproductie en lagere pH zorgen voor kleurverandering) → Y. enterocolitica vormt kolonies met een dieprood centrum en een transparante rand = bull’s eye

Bespreek Schaedler agar OKE

Bespreek Thiosulfaat Citraat Bile Sucrose (TCBS) agar. OKE

xxx

Bespreek de oxidasetest. OKE

Biochemische test die de aanwezigheid van cytochroom c oxidase in het MO nagaat.

• Cytochroom c oxidase speelt een belangrijke rol in de ademhalingsketen (brengt zuurstof in de cel via oxidatie van cytochroom c)

• Essentieel voor aerobe bacteriën

• Wanneer het reagens (tetramethyl-p-fenyleendiamine, kleurloos) wordt toegevoegd, zal deze binnen 10-20 seconden geoxideerd worden door oxidasepositieve bacteriën naar indofenolblauw, dat gekenmerkt wordt door een donkerpaarse, bijna zwarte kleur.

Bespreek de Kligler test. OKE

De Kligler Iron Agar test (KIA-test) of de Triple Sugar Iron test (TSI-test) is een biochemisch gecombineerd testmedium, waarmee gramnegatieve darmbacteriën (Enterobacteriaceae) geïdentificeerd kunnen worden op basis van suikerfermentatie, gasproductie en H2S-productie.

De ingrediënten van het medium van de buis bestaan uit:

• Peptonen (N-bron en voedingstoffen)

• Kleine hoeveelheid glucose (0,1%), lactose (1%), en bij TSI ook sucrose

• Fenolrood (pH-indicator)

• Thiosulfaat (S-bron) en ijzerzouten

De buis heeft een stomp of butt aan de bodem, en een schuine kant aan de oppervlakte, oftewel een helling of slant.

• De helling/slant is zuurstofrijk → zuurstofrijke afbraak van suikers.

• De stomp/butt is zuurstofarm → fermentatie of zuurstofarme afbraak van suikers.

Principe: glucose - gas - lactose - H2S

• Glucose: Eerst zal glucose gefermenteerd worden en zal dit het hele medium aanzuren (geel). Er is echter weinig glucose en hierdoor zullen bacteriën na een tijd overschakelen op de afbraak van de peptonen (proteolyse) en hierbij basen produceren (rood). Voornamelijk ter hoogte van de helling zal dit zichtbaar worden omdat de zuurstofrijke omgeving de proteolyse aanzienlijk bevordert.

• Gas: Bij fermentatie komt gas vrij, dat zich uit in scheuren of bellen in de agar.

• Lactose: Lactosepositieve bacterïen zullen lactose kunnen fermenteren en dit zal opnieuw het hele medium aanzuren (geel).

• H2S: H2S-positieve bacteriën kunnen thiolsulfaat reduceren en H2S produceren → H2S reageert met ijzerionen (ijzerzouten) tot ijzersulfide = onoplosbaar en zwart van kleur → zwart precipitaat

5 verschillende types kunnen bekomen worden:

• Coli-type: + + + -

• Paracoli-type: + + - -

• Shigella-type: + - - -

• Salmonella-type: + (+) - +

• Citrobacter freundii type: + + + +

Bespreek de MIU-test OKE

De MIU-test is een biochemisch gecombineerd testmedium, waarmee gramnegatieve darmbacteriën (Enterobacteriaceae) geïdentificeerd kunnen worden op basis van motiliteit, indolevorming en urease-activiteit.

Principe:

• Motiliteit: Troebele verspreiding van de bacterie vanuit de entlijn

xxx

Bespreek de gelatinasetest. OKE

De gelatinasetest of de gelatinehydrolysetest bepaalt of bacteriën het enzym gelatinase produceren.

• Gelatinase = extracellulair enzym dat gelatine afbreekt (hydrolyseert) tot aminozuren

• Medium bevat voedingsgelatine en stolt bij lage temperaturen

• Na enting en incubatie wordt de buis in een ijsbad of koelkast gepplaatst

• Gelatinasepositief → medium blijft vloeibaar na koeling (vloeibaarwording of liquefactie) = gelatine is afgebroken

• Gelatinasenegatief → medium stolt na koeling = gelatine is nog steeds intact

Wordt gebruikt voor de identificatie van oa. Serratia

Wordt gebruikt voor de differentiatie van S. aureus (positief) van S. epidermidis (negatief)

Bespreek de ureasetest. OKE

Bepaalt of bacteriën het enzym urease produceert.

• Urease splitst ureum in ammoniak en koolstofdioxide en de toename in ammoniak zorgt voor een verhoging van de pH.

• Fenolrood wordt meestal als pH-indicator gebruikt.

• Ureasepositief → vorming ammoniak en verhoging van de pH → dieproze, rode kleur

• Ureasenegatief → geen vorming van ammoniak en geen verhoging van de pH → geel, oranje kleur blijft behouden

• Oorspronkelijke pH was neutraal, eerder zuur → vandaar reeds in het begin geel, oranje

Bespreek de indooltest. OKE

Bepaalt of de bacterie het enzym tryptofaanase bezit.

• Tryptofaanase zet het aminozuur tryptofaan om in indool, pyruvaat en ammoniak → desaminatie en verdere afsplitsing van zijketens totdat indool overblijft

• Medium bevat tryptofaan (bvb. SIM, MIU)

• Na incubatie wordt het Kovacs-reagens toegevoegd → reageert met indool

• Indoolpostief → rode ring aan de oppervlakte

• Indoolnegatief → de laag blijft geel/bruin

Bespreek de mannitoltest OKE

Bepaalt of de bacterie mannitol kan fermenteren

• Medium bevat mannitol en fenolrood

• Mannitolpositef → mannitolfermentatie en zuurproductie → pH daalt → medium kleurt geel

• Mannitolnegatief → geen mannitolfermentatie en zuurproductie → pH blijft onveranderd → medium blijft rood/roos

Hoe wordt het halofiel karakter nagegaan van een bacterie nagegaan worden? OKE

Nagaan of een bacterie zout (NaCl) nodig heeft om te groeien

• Kiem wordt uitgeënt op kweekmedia met verschillende NaCl-concentraties: van 0% naar 12%

• Wanneer de bacterie enkel kan groeien met NaCl, is deze strikt halofiel → andere Vibrio’s

• Wanneer de bacterie kan groeien zonder NaCl, is deze niet (of minder) strikt halofiel → Vibrio cholerae

• Wanneer de bacterie kan groeien in een hoge NaCl-concentratie, is deze halotolerant

Bespreek de bèta-lactamasetest voor Haemophilus influenzae.

Nagaan of H. influenzae bèta-lactamase produceert → breekt bèta-lactam-antibiotica af door de bèta-lactamring door te knippen

Chromogeen substraat (meestal nitrocefine) → lijkt op een bèta-lactam-antibioticum

• Afbraak van substraat → kleurverandering (rood) → bèta-lactamase aanwezig

• Geen afbraak van substraat → geen kleurverandering (geel) → bèta-lactamase niet aanwezig

Bespreek de hippuraathydrolysetest (Campylobacter). OKE

De test gaat na of een bacterie hippuraat kan afbreken.

Hippuraat wordt door het enzym hippuricase gehydrolyseerd tot glycine en benzoëzuur

Wanneer glycine reageert met het reagens ninhydrine, zal er een paarse kleur gevormd worden

• Campylobacter jejuni is positief → paarse kleur

• Campylobacter coli en alle anderen zijn negatief → geen kleurverandering

Bespreek de indoxyl-acetaat hydrolysetest. OKE

De test gaat na of een bacterie indoxyl-acetaat kan hydrolyseren met esterasen.

Het substraat indoxyl-acetaat wordt gehydrolyseerd door esterase → indoxyl → oxideert spontaat → blauwgroen eindproduct

• Campylobacter jejuni, coli en upsaliensis = positief → bevatten esterase → vorming blauwgroene kleur

• De rest = negatief → bevatten geen esterase = negatief → geen kleurverandering