Proteine

processamento trasporto e modificazioni post-traduzionali delle proteine e produzione di proteine eterologhe; ingegneria proteica + proteine intrinsecamente disordinate

Le proteine citoplasmatiche come gli enzimi della glicolisi vengono sintetizzate: (a. Ribosomi RER; b. SER; c. Ribosomi liberi; d. Membrana nucleare)

RISPOSTA: c. Dai ribosomi liberi nel citoplasma. Le proteine destinate al citosol, nucleo, mitocondri o perossisomi non entrano nel pathway di secrezione e completano la sintesi sui ribosomi non associati alle membrane.

Affermazioni VERE sul traslocone Sec61: (1. Eterotrimero; 2. Struttura ad anello; 3. Proteina integrale; 4. Contiene RNA 7S)

RISPOSTA: d. Sono corrette 1, 2, 3 e 4. Sec61 è il poro centrale del complesso di traslocazione; l'RNA 7S fa parte della particella SRP che indirizza il complesso ribosoma-nascente al traslocone stesso.

Le sequenze segnale sono: (a. Peptidi di indirizzamento; b. Glicoproteine di trasporto; c. Segnali nucleari; d. Segnali di degradazione)

RISPOSTA: a. Brevi sequenze peptidiche per indirizzare il trasporto. Funzionano come "codici di avviamento postale" molecolari, solitamente rimossi dalla peptidasi del segnale una volta raggiunta la destinazione.

Il segnale di localizzazione nucleare (NLS) è ricco in quali amminoacidi?: (a. Lys e Arg; b. Gln e Asn; c. Ser e Thr; d. Trp e His)

RISPOSTA: a. Lisina e Arginina. Questi residui basici carichi positivamente permettono l'interazione con le importine per il passaggio attraverso il complesso del poro nucleare (NPC).

Affermazioni VERE sul trasporto nucleare: (1. Consumo GTP citosol; 2. Ran-GTP nucleo-citosol; 3. Ran-GTP per rilascio cargo; 4. Legame diretto)

RISPOSTA: a. Sono corrette 1 e 3. L'idrolisi del GTP avviene nel citosol ad opera di Ran-GAP; nel nucleo, il legame di Ran-GTP all'importina è fondamentale per provocare il rilascio del cargo proteico.

Le proteine di secrezione vengono sintetizzate: (a. Ribosomi citoplasma; b. Ribosomi RER; c. Membrana nucleare; d. Tutti i precedenti)

RISPOSTA: b. Dai ribosomi sul reticolo endoplasmatico rugoso (RER). La sintesi è co-traduzionale: il ribosoma viene ancorato alla membrana del RE appena emerge il peptide segnale.

Il peptide-segnale per una proteina di secrezione è: (a. Idrofobico N-term; b. Idrofilo N-term; c. Idrofobico C-term; d. Solforato N-term)

RISPOSTA: a. Ricco in amminoacidi idrofobici nella regione centrale a N-terminale. Questa idrofobicità è cruciale per l'inserimento nel traslocone Sec61 e l'attraversamento della membrana.

Successione corretta nel pathway di secrezione:

RISPOSTA: b. Citoplasma => Lume RER => cis Golgi => median Golgi => trans Golgi => vescicole => membrana plasmatica => esocitosi. Il flusso è anterogrado e segue la maturazione delle cisterne del Golgi.

Affermazioni VERE sulla N-glicosilazione: (1. Dolicolo-P; 2. Tunicamicina; 3. Rimozione zuccheri; 4. Eubatteri ai mammiferi)

RISPOSTA: b. Sono corrette 1, 2 e 3. Il dolicolo è il supporto lipidico; la tunicamicina è l'inibitore specifico dello step iniziale. La N-glicosilazione complessa (Asn-X-Ser/Thr) è però tipicamente eucariotica e archeobatterica.

Affermazioni VERE sul sistema pET (E. coli): (1. Uso in E. coli; 2. Elementi batterici e fagici; 3. Alta espressione; 4. Sistema inducibile leaky)

RISPOSTA: c. Sono corrette 2 e 4. Utilizza la RNA polimerasi del fago T7; è "leaky" perché può esserci una espressione basale del gene target anche in assenza di induttore (IPTG).

L'espressione di un gene eucariotico in procarioti richiede: (1. Sequenza SD; 2. Assenza introni; 3. Regolazione a monte; 4. Proteina fusione)

RISPOSTA: a. Sono corrette 1, 2 e 3. Serve la sequenza Shine-Dalgarno per il ribosoma, l'uso di cDNA (senza introni poiché i batteri non fanno splicing) e promotori procariotici forti.

La cromatografia di affinità ha a che fare con: (a. Legame specifico; b. Interazioni prot-prot; c. Interazioni carboidrati; d. Nessuna)

RISPOSTA: a. Il legame specifico di una porzione di proteina con un’altra molecola. Si basa sull'affinità reversibile tra la proteina (o un suo tag come l'His-tag) e un ligando immobilizzato sulla matrice.

Affermazione FALSA sui corpi di inclusione: (1. Temperatura ridotta; 2. Centrifugazione; 3. Detergenti/Solventi; 4. Basse temperature per disaggregare)

RISPOSTA: e. È falsa solo la 4. Le basse temperature possono prevenire la formazione degli aggregati durante la crescita, ma una volta formati, i corpi di inclusione richiedono agenti denaturanti (urea/guanidina) per essere solubilizzati.

Ordine corretto dei passaggi nel DNA shuffling: (a. PCR senza/con primers/DNAse; b. PCR con/DNAse/PCR senza; c. DNAse/PCR senza/PCR con/Selezione)

RISPOSTA: c. Frammentazione con DNAse => PCR senza primers => PCR con primers => selezione. Il processo mima la ricombinazione sessuale: la DNasi I crea frammenti che si riassemblano per omologia (self-priming) prima dell'amplificazione finale.

Affermazioni VERE sulla strategia di mutagenesi casuale ricombinativa: (1. Solo PCR; 2. Singolo gene; 3. Conoscenze strutturali; 4. Più varianti iniziali)

RISPOSTA: e. È corretta solo la 4. I metodi ricombinativi (come il DNA shuffling) richiedono una "library" di varianti geniche di partenza per permettere lo scambio di segmenti (chimerismo), a differenza della mutagenesi puntiforme.

Affermazioni VERE sulla mutagenesi a saturazione: (1. Su uno o più codoni; 2. 64 varianti aa; 3. Oligo degenerati; 4. Ceppi E. coli codice alterato)

RISPOSTA: d. È corretta solo la 4 (Nota: In contesti standard sono vere la 1 e la 3. La saturazione usa oligo degenerati NNK/NNS per testare tutti i 20 amminoacidi in una posizione specifica).

Condizioni che aumentano l'errore nella PCR (error-prone mutagenesis): (1. Alta conc. Mg2+; 2. Presenza Mn2+; 3. Presenza alcool; 4. dNTP sbilanciati)

RISPOSTA: d. Sono corrette 1, 2, 3 e 4. Queste condizioni riducono la fedeltà della Taq polimerasi, stabilizzando appaiamenti errati o forzando l'incorporazione di nucleotidi meno disponibili.

Raggio idrodinamico di una proteina intrinsecamente disordinata (IDP) rispetto a una globulare

RISPOSTA: a. Mediamente maggiore rispetto a quello di proteine globulari di pari peso molecolare. Le IDP occupano un volume maggiore perché non sono ripiegate in un core compatto, espandendosi maggiormente nel solvente.

Mobilità elettroforetica (SDS-PAGE) delle proteine IDP

RISPOSTA: b. Mediamente inferiore rispetto a quella di proteine globulari di pari peso molecolare. A causa del "compositional bias" e della struttura estesa, le IDP legano meno SDS o migrano in modo anomalo, sembrando più grandi (e quindi più lente) di quanto siano.

Causa dell'anomala mobilità elettroforetica delle IDP in SDS-PAGE

RISPOSTA: b. Stato conformazionale. La mancanza di un ripiegamento compatto e la composizione peculiare alterano il rapporto carica/massa durante la corsa elettroforetica.

Composizione amminoacidica delle IDP (Compositional Bias) rispetto alle globulari

RISPOSTA: e. È corretta solo la 4 (Amminoacidi idrofobi meno frequenti e carica netta maggiore). Le IDP sono ricche di amminoacidi carichi e polari (promotori del disordine) e povere di residui idrofobici (che formerebbero il core).

Caratteristiche fisiche delle IDP rispetto alle proteine globulari

RISPOSTA: b. Più flessibili. La mancanza di una struttura terziaria stabile permette alle IDP di adottare molteplici conformazioni, facilitando l'interazione con diversi partner molecolari.

Meccanismi di trasformazione da proto-oncogene a oncogene

RISPOSTA: d. Sono corrette 1, 2, 3 e 4. La trasformazione può avvenire per alterazione della sequenza (mutazioni puntiformi), della quantità (amplificazione) o della posizione/controllo (traslocazione).