PSP T7: Cromatografía

Define cromatografía:

Técnica de fraccionamiento de los solutos debido a la distribucional diferencial de los solutos entre una fase móvil y una estacionaria.

Especialización de la separación por adsorción en columna

¿En qué momento se encuentra?

• Purificación

¿Qué dos tipos de utilización tiene la cromatografía?

• Cromatografía analítica → finalidad: separación, identificación y cuantificación de las impurezas y el producto (caracterizar productos de las muestras). Aplicaciones:

  • Análisis biomédicos y medioambientales

  • Diagnosis

  • Monitoraje de procesos

• Cromatografía preparativa → finalidad: separación de impurezas y recuperación de producto. Aplicaciones:

  • Purificación de productos biofarmacéuticos (ej: proteínas, lípidos, hormonas, …)

  • Purificación de productos nutracéuticos y de la industria alimentaria

Compara las características de adsorción con las de una cromatografía:

Adsorción:

• Alta capacidad

• Selectivo

• Etapas iniciales → pre-cleaning: separar productos con diferentes propiedades físio-químicas

Cromatografía:

• Baja capacidad

• Muy selectivo

• Etapas finales del proceso

• Equipos más sofisticados

• Caro → 70-80% del coste del downstream

¿Qué etapas tiene una cromatografía?

1. Empacar la columna

2. Inyección de la muestra

3. Separación de los solutos dependiendo de su afinidad con la fase estacionaria

4. Lavado de la columna (Regeneración)

5. Higienización

6. Desempacar / Almacenaje

Si un producto tiene — afinidad por la FE, tardará más tiempo en salir de la columna

más

¿Por qué es tan cara la cromatografía?

No solo está la columna, sino que tiene muchos equipos adicionales:

• Bomba

• Detectores:

  • Absobancia

  • UV

  • Fluorescencia

  • Conductividad

  • pH → importante en cromatografía iónica

  • Diferencial de presión → importante para evitar la colmatación de la columna (obstrucción de la columna)

¿Qué tipos de separación hay en una cromatografía?

• Intercambio iónica

• Fase reversa / interacciones hidrofóbicas

• Exclusión por tamaño

• Afinidad

iguales que en adsorción menos la de exclusión por tamaño

¿Qué técnicas hay para separar en una cromatografía? Ordénalas en función de su prevalencia en el sistema de bioseparación

1. Intercambio iónico

2. Afinidad

3. Interacciones hidrofóbicas

4. Fase reversa

5. Gel filtración

¿En qué se basa y cuáles so las características de la siguiente técnica?

Intercambio iónico

• Separación basada en carga: intercambio catiónico o aniónico

• Características:

  • Alta capacidad

  • Bajo coste

  • Fácil manipulación de la carga neta de las proteínas

¿En qué se basa y cuáles so las características de la siguiente técnica?

Afinidad

• Separación basada en la interacción específica con un ligando

• Características: alta selectividad

¿En qué se basa y cuáles so las características de la siguiente técnica?

Interacciones hidrofóbicas

• Separación basada en interacciones hidrofóbicas

• Características: fácil manipulación de las interacciones hidrofóbicas con sal

¿En qué se basa y cuáles so las características de la siguiente técnica?

Fase reversa

• Separación basada en interacciones hidrofóbicas

• Desventaja: uso de solventes orgánicos → desnaturalización de proteínas

¿En qué se basa y cuáles so las características de la siguiente técnica?

Gel filtración

• Separación basada en el tamaño de partícula

• Desventaja: poca resolución

¿En qué se basa una separación por exclusión por tamaño?

Permite separar partículas de distintos tamaños según su capacidad de entrar en los poros de la resina

• Baja resolución

• Se necesitan columnas muy largas para separar partículas con tamaños similares

• Se puede utilizar a escala lab para cambiar de matriz, pero para eso ya puedes diafiltrar que funciona mejor y es más barato

¿Cuáles son las etapas en una cromatografía de intercambio iónico?

1. Equilibración: tampón de carga

2. Carga: se une el producto y algunas impurezas, otras salen

3. Lavado: se desunen impurezas de unión débil con tampón de carga

4. Elución: se desune el producto con concentración de NaCl alta

5. Regeneración: se desunen impurezas residuales con concentración de NaCl muy alta → 2M

6. Higienización: se eliminan microorganismos con NaOH 0,5M para degradar materia orgánica

7. Almacenamiento: 20% de EtOH para evitar crecimiento de microorganismos

Resuelve este ejercicio para una cromatografía de intercambio iónico:

¿Cuáles son las etapas en una cromatografía de interacción hidrofóbica?

1. Equilibración: buffer con concentración de sal muy alta: la sal expone las regiones hidrofóbicas de las proteínas

2. Carga: tampón con la muestra y con concentración de sal muy alta

3. Lavado: mismo tampón de carga

4. Elución: reducción progresiva de concentración de NaCl, las proteínas salen en orden de hidrofobicidad

5. Regeneración: tampón sin sal (elimina las proteínas residuales)

6. Higienización: se eliminan microorganismos con NaOH 0,5M para degradar materia orgánica

7. Almacenamiento: 20% de EtOH para evitar crecimiento de microorganismos

Resuelve este ejercicio para cromatografía de interacciones hidrofóbicas:

¿Qué modos de operación hay en una cromatografía líquido-líquido?

1. Unión y elución → las más utilizadas

• La proteína de interés y algunas impurezas se unen a la columna

• La separación se realiza por la acción de un tampón de elución

  • Elución por pasos o etapas → escalón

  • Elución por gradiente lineal → sirve para caracterizar el sistema, se dan a conocer las concentraciones de sal para usar en escalón

• Más resolución y selectividad

Cromatografía isocrática → las que trataremos en este tema

• Las impurezas y el producto son retenidas por la resina diferencialmente según su coeficiente de distribución

• La fase móvil no cambia

¿Qué es el factor de capacidad? (k’)

Es la medida para cuantificar la interacción de un soluto con la fase estacionaria

¿Qué prefieres que tenga más afinidad por la columna, el producto o las impurezas?

Del que tengas menos

En isocráticas es común la retención de impurezas con k’ elevados comparados con k’ bajos de los productos de interés

¿Qué ocurre si el factor de capacidad (k’) del producto de interés es superior a 10?

No se puede hacer una elución isocrática, sino que se tiene que eluir modo unión-elución (variando la FM)

¿Qué es tm?

Es el tiempo de retención de la fase móvil

¿Qué es tr’?

Es el tiempo de retención ajustado: es el tiempo de retención del producto menos el tiempo de retención de la fase móvil

¿Qué es ε?

ε = la fracción de volumen muerto de la columna → fracción que ocupa la fase móvil

para saber que fracción ocupa la FE = 1 - ε

¿Cómo queremos que sean los picos en un cromatograma?

Picos altos y estrechos

¿Por qué motivos los picos se ensanchan?

• Interacciones con la fase estacionaria → si hay interacciones, más lento saldrá el producto por lo que el pico será más amplio

• Inyección no ideal → quiero alimentar el producto de manera de que haya la mayor concentración posible

• Dispersión radial → la carga debe de ser uniforme en toda la superficie de la columna

• Dispersión axial → si hay caminos preferentes, habrán zonas más rápidas y zonas más lentas, por lo que será más amplio el pico (el producto saldrá a tiempos diferentes)

• Dispersión difusional ??

¿Qué es la selectividad?

• Es la capacidad de diferenciar un compuesto de otro

• Debe de ser entre 1,1 < α < 1,5

• Es independiente de la concentración

¿Qué es la resolución?

• Es lo bien que se separan dos picos

• R > 1,5

• Es dependiente de la concentración (amplitud)

Di si tiene buena selectividad y resolución:

Tiene buena selectividad pero mala resolución

Di si tiene buena selectividad y resolución:

Tiene buena selectividad y buena resolución

Si ½ w1 + ½ w2 > tr2- tr1 → buena separación

¿Qué son HETP? ¿Qué es N?

HETP: altura equivalente de los platos teóricos

N: número de platos teóricos → número de etapas equivalentes en la columna

A — número de platos teóricos, mejor separación

A — HETP, mejor separación

• mayor

• menor

A — velocidad de la FM (u), se disminuye el efecto de la dispersión axial

mayor

Sin embargo, incrementa la limitación por dispersión difusional

¿Por qué el empacado de la columna es crítico?

El empacado de la columna tiene que ser homogéneo y de alta calidad, ya que si hay irregularidades estas pueden causar caminos preferenciales en el lecho de la columna que impactarán en el rendimiento y la pureza de la separación

¿Qué maneras hay de empacar la columna?

Empacar por gravedad:

• La columna sed rellena con la resina y se deja depositar por gravedad para crear el lecho

• Se suele hacer en escala lab

• Desventajas

  • Las partículas grandes se depositan más rápido

  • El lecho sufre compresión al aplicar el flujo de trabajo

  • Lento

  • Se pueden crear gradientes, ya que como las partículas caen por sedimentación, las partículas grandes quedan abajo y las pequeñas arriba

Empacar la columna con flujo:

• La resina es introducida en la columna juntamente con la fase móvil mediante una bomba a un flujo constante para promover una rápida deposición de las partículas de la resina → FE y FM se ponen a la vez para que la FE deposite rápidamente

¿Cómo se mide la calidad del empacado?

1. Inyectar un pulso de un trazador que no interactúe con la FE (ej: NaCl)

   • La concentración del trazador tiene que ser mesurable

   • El trazador tiene que poder pasar a través de los poros del lecho de la columna

2. Desplazar el pulso a través de la columna con una FM apropiada en las condiciones de trabajo

3. Analizar la salida del trazador

   • Asimetría del pico

   • HETP

¿Cómo se clacula la asimetría y cuál es su valor esperado?

As = B/A

• A = amplitud de la primera mitad del pico a 10% de la altura total

• B = amplitud de la segunda mitad del pico a 10% de la altura total

• Valor ideal → 1

• Rango esperado → 0,8-1,5

Idealmente, los picos de un cromatograma siguen una distribución —

Normal o gaussiana

La amplitud del pico es — veces la desviación estándar si se sigue una distribución gaussiana

4

dispersión estándar = w / 4

Nos movemos desde -2 SD hasta +2 SD

¿Qué es un proceso de normalización?

Convertir todos los picos en curvas normales con media = 0 y dispersión estándar = 1

¿Qué describe la función de densidad?

Describe la concentración a la salida de la columna dependiendo del tiempo de retención y la desviación estándard

¿Qué es la función de distribución (FDist)?

• Sale de integrar la función de la densidad entre los dos tiempos entre los cuales sale el producto

• Indica la fracción de área entre dos tiempos y permite calcular la pureza y el rendimiento

No se puede trabajar a flujos muy alto (u) debido a la limitación por dispersión difusional. ¿Qué tipo de cromatografía se puede hacer para que no afecte la dispersión difusional?

Utilizar una cromatografía de membranas → se utilizan membranas con microporos que tienen un ligando, haciendo que el producto se una en el proceso de filtración

¿Qué características tiene la cromatografía de membranas?

• Volumen y tiempos de residencia menores

• Transporte del soluto a los sitios de unión por convección (en columna es por difusión)

• Caudales mayores (tiempos de residencia menores)

• Resolución equivalente a las columnas de cromatografía

• Utilizado comúnmente en modo isocrático donde se unen las impurezas

• Capacidades de unión menores que en cromatografías convencionales

¿Qué características tiene el escalado?

• Se escala el volumen/masa FE, manteniendo constante la resolución y los tiempos de residencia:

  • mantener cte la altura/longitud de la columna (h) y la velocidad superficial entre escalas (u): h1=h2 y u1=u2 → Q1/A1 = Q2/A2

  • mantener cte la relación entre gramos de proteínas adicionads y volumen de la columna entre escalas

• Columnas más largas: mayor rendimiento

• Columnas más anchas: mayor pureza

¿Qué procedimiento se sigue para el escalado de la columna?

1. Estudios de la capacidad de unión en dinámico a escala laboratorio para obtener los parámetros óptimos (máx capacidad de unión, tipo de resina, caudal, pH, …) utilizando la misma solución que se quiere purificar a escala piloto-industrial

2. Diseño a escala piloto-industrial utilizando el mismo adsorbente/resina