09 hodnocení toxicity látek

základní způsoby zjišťování toxicity látek a materiálů (3)

• případové a epidemiologické studie (retro i prospektivní)

• experimentální metody (prediktivní)

• počítačové modelování in silico (prediktivní)

případové a epidemiologické studie

• epidemiologické studie

  • v pracovním prostředí

  • v životním prostředí

  • v důsledku havárií

• klinické studie

  • záměrná kontrolovaná expozice dobrovolníků

experimentální metody

• in vivo - experimenty s živými organismy

• ex vivo - experimenty s částmi živých organismů

• in vitro modely

dělení epidemiologických studií dle způsobu realizace

• obzervační (pozorovací) studie - bez přímého vlivu na probíhající děj

  • deskriptivní studie - popis rozložení negativního účinku v populaci

  • analytické studie - objasnění příčin vzniku negativního účinku

• intervenční (experimentální) studie - kontrolovaná a řízená expozice sledované látce, optimalizované podmínky

dělení epidemiologických studií dle časového hlediska

• prospektivní

  • sledování začíná s počátkem expozice (nebo i dříve)

• retrospektivní

  • sledování začíná v průběhu nebo po ukončení expozice

typy obzervačních studií (7)

postupně roste kvalita výpovědi:

• kazuistiky

• série případů

• ekologické studie

• surveillance

• průřezové studie

• studie případů a kontrol

• kohortové studie

které z následujících metod jsou deskriptivní a které analytické?

• kazuistiky

• série případů

• ekologické studie

• surveillance

• průřezové studie

• studie případů a kontrol

• kohortové studie

• kazuistiky - deskriptivní

• série případů - deskriptivní

• ekologické studie - deskriptivní

• surveillance - deskriptivní i analytické

• průřezové studie - deskriptivní i analytické

• studie případů a kontrol - analytické

• kohortové studie - analytické

typy intervenčních studií (2)

postupně roste kvalita výpovědi:

• klinické studie

• terénní kontrolované studie

kazuistika

detailní popis průběhu intoxikace jedince

série případů

detailní popis série případů intoxikací

surveillance

• propojení řady sérií případů a kazuistik

• cílem je

  • detekce a popis problému

  • formulace hypotéz o příčinách problému a způsobech řešení

    • akutní situace - hromadné otravy

ekologická (korelační studie)

• vztah mezi negativními účinky a rizikovým faktorem na úrovni populace

• klíčová data jen na skupinové úrovni, ne individuální

průřezové studie

• retrospektivní

• náhodný výběr jedinců ze studované populace

• jednorázový sběr dat o zdravotním stavu a úrovni expozice

• rozdělení výběru na 4 skupiny:

  • exponovaní s negativnímu účinky

  • exponovaní bez negativních účinku

  • neexponovaní s negativnímu účinky

  • neexponovaní bez negativních účinku

• vhodné pro sledování chronických účinků

studie případů a kontrol

• retrospektivní analytická studie

• testování hypotéz o vztahu mezi expozicí a negativními účinky

• nejprve identifikace případů = jedinci se zjištěnými negativními účinky

• poté výběr skupiny kontrol = jedinci bez sledovaných účinků, ale v ostatních parametrech co nejvíce podobní případům

• v obou skupinách je hodnocena úroveň expozice

kohortové studie

• prospektivní analytické studie

• testování hypotéz o vztahu expozice a negativních účinků

• skupiny jedinců (kohorty) složeny z jedinců nevykazujících na počátku studie sledovaný zdravotní efekt

• jednotlivé kohorty se liší úrovní expozice (např. exponovaná a neexponovaná)

• kohorty nějakou dobu (několik let) sledovány → v kohortách zaznamenávány jednotlivé případy onemocnění

příklady epidemiologických studií

• hromadné otravy - metanolová aféra (ČR, 2012)

• epidemiologické studie - kontaminanty v pitné vodě

  • problematická prokazatelnost

faktory ohrožující kvalitu informací v epidemiologických studiích

• odlišnost faktorů osob v cílové populaci - věk, fyzická kondice, …

• vedlejší expozice - kouření, výživa, …

• nepřesnosti vzniklé při sběru dat

biologický limit

• + kdy se detekuje

• = úroveň expozice, která ani při dlouhodobém opakování nepoškodí zdraví exponovaných osob

• detekuje se během detekčního okna, to záleží na koncentraci ve vzorku, metodě a metabolizaci látky

standardizace in vivo metod (2)

• OECD = Organisation for Economic Cooperation and Development

• ISO = International Organisation for Standardization

s čím se dá experimentovat ex vivo a in vitro (4)

• izolované orgány

• tkáňové kultury

• buněčné organely a extrakty

• purifikované makromolekuly

toxikometrie

• = hodnocení vztahu dávka-účinek

• = kvantitativní hodnocení toxicity a nebezpečnosti potenciálně toxických látek

MLR

maximální limit reziduí

u výsledků testů toxicity nutné vždy uvádět …

expoziční cestu

škála in vitro (2) a in vivo (4) testů

• in vitro

  • mutagenita

  • dráždivé a leptavé účinky

• in vivo

  • akutní

  • subakutní

  • subchronické

  • chronické

akutní toxicita

• aplikace jedné dávky, krátkodobá expozice nebo několik dávek během 24 h

  • většinou na potkanech

• výchozí zkouška pro další toxikologické studie

• → LD50, LC50

OECD - akutní orální toxicita - acute toxic class

• 2-4 kroky

• 1. 3 zvířata stejného pohlaví dostávají 200 mg/kg

• podle reakce na 1. dávku se pokračuje

• → zařazení látky do třídy toxicity (ne přesná LD50)

OECD - akutní orální toxicita - up and down procedure

• 1. 1 zvířeti podán odhad LD50

• zemře → nižší dávka

• nezemře → vyšší dávka

• → hraniční dávky pro přesnější odhad LD50

OECD - akutní inhalační toxicita

• stanovení LC50 - poloviční letální koncentrace

  • úhyn 50 % zvířat po 4hodinové expozici

  • min 3 koncentrace

• pozorování 14 dní, makroskopická pitva

OECD - akutní dermální toxicita

• stanovení LD50 po krátkodobé dermální aplikaci (mg/kg)

  • hřbet po depilaci, cca 10 % povrchu těla

  • aplikace jako roztok, suspenze, kaše

• králík, potkan, morče

in vitro modely lidské kůže - EpiDerm, Episkin

• 3D model - epidermis s funkčním stratum corneum

• cytotoxicita vyjádřena jako snížení aktivity enzymu mitochondriální dehydrogenázy = MTT

in vitro model EpiOcular

• 3D model - lidské keratinocyty

• MTT

• inkubace 3 min, 30 min, 60 min

testy subakutní toxicity

• 28 dní, expozice 1x denně

• odvozeno z 1/10 LD50, 1/10 LC50 akutního testu

• provádí se pitvy

testy subchronické toxicity

• 90 dní, expozice 1x denně

• provádí se pitvy, histopatologie

testy chronické toxicity

• expozice po většinu života zvířete

• potkani 24 měsíců, myši a křečci 18 měsíců

• modelování pracovního prostředí - 5x v týdnu

testy reprodukční toxicity

• vícegenerační

• sleduje se toxicita pro rodiče i potomky

testy genotoxicity

• série testů - s metabolickou aktivací i bez ní

  • test na genovou mutaci bakterií (Amesův test), kvasinek, lidských buněk

  • test na chromozomální poškození savčích buněk

testy karcinogenity

• expozice v nízkých koncentracích, ale dlouhodobě

• minimálně 3 různé koncentrace (1 bez příznaků, 1 výrazně toxická)

další testy (4)

• endokrinní disrupce

• imunotoxicita

• neurotoxicita

• toxikokinetické studie

organismy používané pro ekotoxikologické biotesty

• modely na všech úrovních potravního řetězce

  • producenti (fotoautotrofní) - řasy, sinice, vyšší rostliny

  • konzumenti - bezobratlí, obojživelníci, ryby, ptáci, savci

  • destruenti - bakterie, kvasinky

NAMs

• New Approach Methodologies

• = metodologie nového přístupu

• in vitro nebo in silico → minimalizace testování na zvířatech

pouze …% shoda výsledků z testů na hlodavcích s výsledky klinických studií

43

v klinické fázi testování selhává až … % potenciálních léčiv

92

EURL-EVCAM

European Union Reference Laboratory for alternatives to animal testing

EURL-NETVAL

European Union Network of Laboratories for the Validation of Alternative Methods

HTS

High-Throughput Screening Assays

• automatizované systémy

PBPK models

Physiologically based pharmacokinetic models

• in silico farmakokinetické modely

expertní in silico systémy

• DEREK

• OncoLogic

QSAR

quantitative structure-activity relationships

• analýza série strukturně podobných látek

• BA_i = f(X_i)

  • BA = biologický účinek

  • X = vlastnost chemické látky

• dle EU přímo jmenovány mezi metodami pro hodnocení chemických látek