Phương pháp và kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử

Các thẻ từ vựng về các công cụ, enzym, và kỹ thuật cơ bản trong sinh học phân tử như PCR, giải trình tự gen và các chủng vi khuẩn phổ biến.

Escherichia coli (E. coli)

Chủng vi sinh vật thường được sử dụng trong sinh học phân tử do bộ máy di truyền đã được nghiên cứu đây đủ, tốc độ tăng trưởng nhanh và khả năng gây bệnh thấp.

Chủng JM109

Chủng E. coli xuất phát từ $K12$, dùng để nhân bản vector phage $M13$ và plasmid $pUC$, có đột biến gen $recA$ làm mất khả năng tái tổ hợp tương đồng.

Kỹ thuật bổ sung alpha (alpha complementation)

Kỹ thuật sử dụng phần gen $\beta\text{-galactosidase}$ trên NST bị mất và gen cho đoạn omega trên plasmid để chọn lọc dòng tái tổ hợp.

Chủng DH5-\text{\alpha}

Chủng vi khuẩn có đặc tính bổ sung alpha, đột biến $recA1$ và đột biến $deoR$ giúp dễ dàng thu nhận các mảnh DNA lớn.

Vector tạo dòng

Vật liệu di truyền trung gian để chuyển gen giữa các tế bào, có khả năng sao chép độc lập và mang yếu tố chọn lọc.

Plasmid

Phân tử DNA sợi đôi, dạng vòng kín, nhỏ, có khả năng nhân bản độc lập với nhiễm sắc thể trong tế bào.

Ori (Origin of replication)

Điểm khởi đầu sao chép cho phép nhân bản plasmid trong tế bào chất mà không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể.

MCS (Multiple Cloning Site)

Vùng tạo dòng là một trình tự DNA ngắn mang nhiều trình tự nhận diện duy nhất của các enzyme giới hạn khác nhau nằm liên tiếp (polylinker).

Plasmid pUC

Dãy các plasmid có kích thước $2,7\,kb$, mang gen kháng ampicillin, điểm Ori từ $pBR322$ và một phần gen $lacZ$ của E. coli.

Plasmid pBR322

Plasmid dài $4363\,bp$, dùng tạo dòng nhanh và đơn giản, có gen kháng tetracycline và ampicillin.

Enzym cắt hạn chế (Restriction enzyme - RE)

Các endonuclease có khả năng cắt DNA tại hoặc gần một trình tự nhận diện đặc hiệu.

RE Loại II

Loại enzyme giới hạn chỉ có hoạt tính endonuclease, không cần $ATP$ và cắt DNA tại hoặc rất gần vị trí nhận diện.

Đầu dính (Sticky ends)

Kiểu cắt DNA so le tạo ra các đầu đơn bổ sung cho nhau, ví dụ như kết quả cắt của $BamHI$.

Palindrom

Kiểu trình tự nhận diện có sự đối xứng, thường thấy ở đa số vị trí cắt của các enzyme giới hạn loại II.

DNA polymerase phụ thuộc DNA

Enzym sao chép dùng để tổng hợp mạch DNA mới từ khuôn DNA có sẵn.

Hoạt tính exonuclease $3'\text{- } 5'$

Chức năng "sửa lỗi" của polymerase, giúp loại bỏ các nucleotide bị gắn sai ở đầu $3'$.

DNA polymerase I

Polymerase phụ thuộc DNA từ E. coli, có hoạt tính tổng hợp $5'\text{- } 3'$ và cả hai hoạt tính exonuclease $3'\text{- } 5'$ và $5'\text{- } 3'$.

Đoạn Klenow

Sản phẩm thu được từ polymerase I không còn hoạt tính exonuclease $5'\text{- } 3'$, dùng để làm tà đầu dính hoặc giải trình tự DNA.

Ligase

Enzyme xúc tác phản ứng tạo liên kết phosphodiester giữa đầu $3'\text{-OH}$ và $5'\text{-P}$ của hai sợi acid nucleic.

Phương pháp thủy giải kiềm

Kỹ thuật tách plasmid dựa trên việc nâng $pH$ lên $12 - 12,5$ để làm biến tính DNA thẳng nhưng giữ nguyên DNA plasmid siêu xoắn (supercoil).

Định lượng acid nucleic tại $260\,nm$

Sử dụng quang phổ kế; $1$ đơn vị $OD260$ tương đương với $50\,\mu g/ml$ DNA sợi đôi hoặc $40\,\mu g/ml$ RNA sợi đơn.

Lai acid nucleic (Hybridization)

Quá trình hai phân tử acid nucleic sợi đơn bắt cặp bổ sung bằng liên kết hydro để tạo thành sợi đôi.

Nhiệt độ chảy (Tm)

Nhiệt độ tại đó $50\%$ số duplex được hình thành, tính bằng công thức $Tm = 4(GC) + 2(AT)$.

Southern blot

Kỹ thuật lai acid nucleic được thực hiện với DNA sau khi đã được điện di và chuyển lên màng.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Kỹ thuật khuếch đại DNA in vitro dựa trên các chu kỳ nhiệt: biến tính, gắn mồi và kéo dài.

Taq DNA polymerase

Enzyme polymerase chịu nhiệt ly trích từ Thermus aquaticus, hoạt động tối ưu ở $75 - 80^oC$.

RT-PCR

Kỹ thuật kết hợp phiên mã ngược (Reverse Transcription) và PCR để khuếch đại trình tự từ RNA mẫu.

Real-time PCR

Kỹ thuật định lượng DNA dựa trên việc sử dụng các đầu dò huỳnh quang để phát hiện sản phẩm ngay khi chúng được tạo ra.

Biến nạp (Transformation)

Phương pháp đưa DNA ngoại lai vào tế bào dựa trên khả năng đánh bắt DNA của tế bào khả nạp (thường dùng $CaCl_2$ và sốc nhiệt).

Phương pháp Sanger

Phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme dựa trên sự ngừng tổng hợp DNA khi gặp các dideoxynucleotide (ddNTP).

Phương pháp Maxam-Gilbert

Phương pháp giải trình tự gen bằng hóa học dựa trên sự thủy giải đặc trưng các base của DNA.