Metodologie per la Produzione e Analisi di Proteine Ricombinanti

Flashcards basate sul riassunto tecnico delle metodologie biochimiche e cellulari, coprendo dalla produzione di proteine ricombinanti alle analisi avanzate come FACS, Biacore e colture cellulari.

Quali sono i quattro livelli strutturali di una proteina?

Primaria (sequenza lineare), Secondaria (conformazioni locali come alfa-eliche e foglietti beta), Terziaria (ripiegamento tridimensionale complessivo o folding) e Quaternaria (associazione di più subunità).

Cos'è una proteina ricombinante?

Una proteina prodotta da un organismo ospite che esprime una sequenza di DNA esogeno inserita artificialmente (ORF).

Quali sono le principali modifiche post-traduzionali (PTM) negli eucarioti?

O-glicosilazione su residui di Serina/Treonina ($Ser/Thr$) e N-glicosilazione su Asparagina ($Asn$).

Perché è necessario utilizzare il cDNA anziché il DNA genomico per produrre proteine umane nei batteri?

Perché i batteri non possiedono il macchinario per lo splicing e non sanno rimuovere gli introni presenti nel DNA genomico eucariotico.

Qual è la differenza tra coltura in Batch e coltura Continua?

La coltura in Batch è un sistema chiuso (vasca o beuta) usato per piccole produzioni; la coltura Continua è un sistema aperto a scala industriale con flusso costante di terreno fresco e uscita di terreno esausto.

Quali sono i sei step sperimentali del clonaggio genico?

1. Selezione/Preparazione della ORF; 2. Scelta del vettore; 3. Ligazione; 4. Trasformazione dell'ospite; 5. Selezione dei cloni; 6. Verifica tramite sequenziamento.

Cos'è il clonaggio direzionale e quale vantaggio offre?

È l'uso di due enzimi di restrizione diversi per tagliare l'inserto e il vettore; garantisce l'orientamento corretto dell'inserto rispetto al promotore.

Descrivi il principio del T-A Cloning.

Sfrutta la capacità della Taq polimerasi di aggiungere una Adenina ($A$) sporgente al 3' dei prodotti PCR, che lega un vettore linearizzato con Timine ($T$) sporgenti al 3'.

Quali sono i tre tipi di localizzazione di una proteina ricombinante in un sistema batterico?

Intracellulare (citoplasma), Periplasmatica (spazio tra le membrane nei Gram-negativi, ottimale per ponti disolfuro) ed Extracellulare (secreta nel terreno).

Quali sono i componenti fondamentali di un vettore di espressione?

Promotore, Terminatore, RBS (Sito di legame al ribosoma), MCS (Sito multiplo di clonaggio), ORI (Origine di replicazione) e Marcatore di selezione (resistenza antibiotica).

Come viene indotto il promotore Lac nel sistema E. coli?

Tramite l'aggiunta di $IPTG$, un analogo sintetico non metabolizzabile del lattosio che sequestra il repressore LacI.

Qual è la caratteristica distintiva dei vettori navetta (Shuttle vectors) per i lieviti?

Possono replicarsi sia in $E. coli$ (per ingegnerizzazione) che nel lievito (per espressione), possedendo doppie ORI e doppi marcatori di selezione.

Quali sono gli elementi chiave di un Cromosoma Artificiale di Lievito (YAC)?

$CEN4$ (centromero), $TEL$ (telomeri), $ARS$ (origine di replicazione), marcatori $TRP1$ e $URA3$, e il gene soppressore $SUP4$.

Come funziona il sistema TetON nelle cellule di mammifero?

In assenza di tetraciclina il repressore TetR blocca la trascrizione; l'aggiunta di tetraciclina lega TetR liberando il promotore e attivando l'espressione del gene.

Cos'è il segnale Ψ (psi) nei vettori retrovirali?

È l'elemento essenziale situato tra il promotore e i geni strutturali che funge da segnale per il packaging dell'RNA nei virioni.

Qual è il principio del sistema di espressione nei Baculovirus (cellule d'insetto)?

Sostituzione del gene della poliedrina (espresso in quantità massicce dal virus) con una ORF esogena sotto il controllo dello stesso promotore forte.

Come viene purificata una proteina dotata di His-tag?

Tramite cromatografia d'affinità su metalli immobilizzati (Nichel $Ni^{2+}$ o Cobalto); l'eluizione avviene per competizione con l'imidazolo.

Cosa sono i corpi di inclusione?

Aggregati proteici insolubili e inattivi che precipitano nell'ospite, spesso causati da un folding errato o elevata concentrazione citoplasmatica.

Qual è la forza dell'interazione Streptavidina-Biotina?

È l'interazione non covalente più forte nota in biologia, con una costante di dissociazione $K_d \thickapprox 10^{-15} M$.

Quali sono i componenti chiave di un tampone di estrazione proteica?

Agenti tamponanti (es. TRIS, HEPES), stabilizzatori di osmolarità (Saccarosio), composti tiolici (DTT, 2-mercaptoetanolo) e inibitori delle proteasi (PMSF, Leupeptina).

Quali sono i principali metodi meccanici di lisi cellulare?

French Press, Sonicazione (ultrasuoni), Omogeneizzatori (Potter-Elvehjem) e Glass Beads.

Qual è l'ordine di sedimentazione degli organelli nella centrifugazione differenziale?

1. Nuclei (velocità bassa); 2. Mitocondri/Lisosomi (media); 3. Microsomi (alta/ultracentrifugazione); 4. Citosol (surnatante finale).

Descrivi il principio del Salting Out.

L'aggiunta di alte concentrazioni di sale (es. Solfato d'Ammonio) sottrae acqua ai clatrati attorno ai domini idrofobici del target, causandone l'aggregazione e precipitazione.

Cos'è il fattore di ritardo $R_f$ nella cromatografia su strato sottile (TLC)?

È il rapporto tra la distanza percorsa dal soluto ($a$) e la distanza percorsa dal fronte del solvente ($b$); $R_f = \frac{a}{b}$.

Come funziona la cromatografia di esclusione molecolare (Gel Filtrazione)?

Le molecole vengono separate in base a forma e peso molecolare; le molecole grandi (sopra il limite di esclusione) escono per prime, mentre le piccole entrano nei pori e vengono ritardate.

Qual è la differenza tra scambiatori anionici e cationici nella cromatografia a scambio ionico?

Gli scambiatori anionici hanno fase stazionaria positiva e legano proteine negative; gli scambiatori cationici hanno fase stazionaria negativa e legano proteine positive.

Qual è la legge di Lambert-Beer usata nella quantificazione proteica?

$A = c \times \text{ε} \times l$, dove $A$ è l'assorbanza, $c$ la concentrazione, $\text{ε}$ il coefficiente di estinzione molare e $l$ il cammino ottico.

Quali sono i passaggi chiave del metodo di Lowry?

1. Reazione del Biureto (formazione complesso $Cu^{+}$); 2. Reazione di Folin-Ciocalteu (ossidazione di Tyr/Trp e riduzione del reattivo a Blu di Molibdeno).

Come varia il colore del Coomassie Brilliant Blue G-250 nel test di Bradford?

Il colorante vira dalla forma cationica rossa ($465 \text{ nm}$) alla forma anionica blu ($595 \text{ nm}$) quando si lega alle proteine.

Qual è il ruolo dell'SDS nella tecnica SDS-PAGE?

È un detergente anionico che denatura le proteine e conferisce loro una carica negativa uniforme proporzionale alla lunghezza della catena, permettendo la separazione solo per massa molecolare.

In cosa consiste lo Stacking Gel nel sistema di Laemmli?

È un gel superiore a pH 6,8 con bassa acrilammide dove la glicina zwitterionica e gli ioni $Cl^{-}$ creano una zona ad alta resistenza che impacca le proteine in una banda sottilissima.

Descrivi il principio dell'Isoelettrofocalizzazione (IEF).

Le proteine migrano in un gradiente di pH fino a raggiungere il punto in cui il pH corrisponde al loro punto isoelettrico ($pI$), dove la carica netta è zero e la migrazione si ferma.

Quali sono le due dimensioni dell'elettroforesi 2D?

Prima dimensione: IEF (separazione per carica/pI); Seconda dimensione: SDS-PAGE (separazione per massa/PM).

Cosa misura la spettrometria di massa MALDI-TOF?

Il rapporto massa/carica ($m/z$) degli ioni generati dal campione colpito da un raggio laser in una matrice organica.

In un esperimento di EMSA, cosa indica lo 'shift' della banda?

Indica la formazione di un complesso DNA-proteina, che ha una massa maggiore e quindi una velocità di migrazione inferiore rispetto al DNA libero.

Quali sono i tre metodi principali per la marcatura radioattiva di sonde di DNA?

End Labelling (5' o 3'), Nick Translation (tramite DNAsi I e DNA Polimerasi I) e Random Priming.

Cosa dimostra la tecnica del Supershift?

L'identità specifica della proteina legata al DNA; l'aggiunta di un anticorpo specifico crea un complesso ancora più pesante che ritarda ulteriormente la corsa elettroforetica.

Cos'è uno Zimogramma?

Una tecnica elettroforetica per rilevare l'attività di enzimi idrolitici (come le metalloproteasi) aggiungendo un substrato (es. gelatina) nel gel; le zone di digestione appaiono come bande chiare.

Come si producono gli anticorpi monoclonali tramite ibridomi?

Si fondono linfociti B attivati (provenienti dalla milza di un topo immunizzato) con cellule di mieloma immortali; gli ibridomi vengono selezionati in terreno HAT.

Quali sono le fasi del Western Blotting dopo l'elettroforesi?

1. Trasferimento su membrana (Nitrocellulosa/PVDF); 2. Saturazione (Blocking con latte/BSA); 3. Incubazione con anticorpo primario; 4. Incubazione con anticorpo secondario marcato; 5. Rilevazione (es. ECL).

Descrivi la differenza tra Sandwich ELISA ed ELISA Competitivo.

Nel Sandwich l'intensità del segnale è direttamente proporzionale alla concentrazione (proteina tra due anticorpi); nel Competitivo il segnale è inversamente proporzionale alla concentrazione.

Cosa identificano i parametri Forward Scatter (FSC) e Side Scatter (SSC) nel FACS?

FSC indica le dimensioni cellulari (volume); SSC indica la complessità interna (granularità).

Come si analizza l'apoptosi al citometro a flusso?

Tramite doppia marcatura: Annessina V (lega la fosfatidilserina esposta esternamente nell'apoptosi precoce) e Ioduro di Propidio (entra solo nelle cellule con membrana danneggiata).

Cos'è la Risonanza Plasmonica di Superficie (SPR) usata nel Biacore?

È un fenomeno fisico dove l'interazione tra un ligando (immobilizzato) e un analita (fluente) causa una variazione della massa locale e dell'indice di rifrazione, modificando l'angolo di risonanza della luce riflessa.

Quali sono i quattro fattori di Yamanaka utilizzati per generare le iPSCs?

$OCT3/4$, $SOX2$, $KLF4$ e $c-Myc$.

Qual è la differenza gerarchica tra cellule staminali Totipotenti e Pluripotenti?

Le Totipotenti (es. zigote) possono formare l'intero organismo e i tessuti extra-embrionali; le Pluripotenti (es. staminali embrionali) possono differenziarsi in tutti i tessuti dei tre foglietti germinativi ma non in quelli extra-embrionali.