Les VI

Methylation on GR gene: glucocorticoid receptor (binds cortisol, stress response).

welke invloed heeft maternal behavior op epigenetics?

GR-gen contains CpG-sites, on which methylation can influence expression

NGFI-A is a transcription factor that binds the promoter. More methylation → less binding of NGFI-A → less GR expression

precieze epigenetics op het GR-gen

CpG 16

welke methylation site is het belangrijkste bij het GR-gen op vlak van epigenetics?

E20: just before birth, No methylation!

P1: 1st day of life, Strong methylation!

P6: 6th day of life:, methylation remains in L mothers, disappears in H mothers: first week is decisive!

methylation during mouse lifetime

Trichostatin A (TSA) is an HDAC inhibitor.

TSA

• TSA is een HDAC-inhibitor

  • TSA remt histondeacetylases (HDACs)

  • hierdoor worden acetylgroepen minder verwijderd van histonen

• Meer histonacetylatie

  • histonen blijven sterker geacetyleerd

  • dit leidt tot opener chromatine en verhoogde toegankelijkheid van DNA

• Meer binding van NGFI-A

  • door het opener chromatine kan de transcriptiefactor NGFI-A beter binden aan de promotor van het GR-gen

• Minder DNA-methylatie

  • verhoogde NGFI-A binding gaat gepaard met afname van DNA-methylatie van de GR-promotor

  • hierdoor stijgt de expressie van het glucocorticoid receptor (GR)-gen

• Fenotypisch effect

  • nakomelingen van L-moeders vertonen hierdoor een lagere stressrespons en meer stressresistent gedrag

Principe:
TSA remt HDACs, waardoor chromatine opener wordt via verhoogde histonacetylatie. Dit bevordert NGFI-A binding en GR-expressie, verlaagt DNA-methylatie en kan de stressgevoelige fenotypes van nakomelingen van L-moeders gedeeltelijk omkeren.

effect TSA

NUTRITION CAN REVERSE THE EPI-MUTATION

wat is belangrijk bij epi-mutations?

Vitamin B11 (folic acid)

Vit. B12 (cobalamin)

Methionine

Choline

(for SAM)

belangrijke methyl donors voor epigenetica patronen door voeding

Biotin (B7)

vitamine dat histone biotinylation beïnvloedt

Niacin (B3)

vitamine dat betrokken is in histone ADP ribosylation and histone deacetylation

Panthothenic acid (B5)

vitamine dat precursor is of acetyl-CoA (histone acetylation)

Epigenetic changes are responsible for differences in the phenotypes of honeybee (Apis mellifera) queens (left) and workers (right).

Queens and workers are genetically identical, yet develop into dramatically different castes.

uitleg phenotypic plasticity bij bijen

Royal jelly is a nutrient rich secretion produced by worker bees, primarily used to feed queen bees (throughout their life) and larvae (temporarily)

Royal jelly

Royal jelly silences the Dnmt3 gene → less DNA methylation.

Consequences:

Genes usually silenced in worker bees become active.

Activation of these genes drives development of:

Functional ovaries (reproductive physiology)

Larger body size

effect royal jelly

Royal jelly is not just a nutritional secretion: research now shows it contains multiple classes of non-coding RNAs, including miRNAs, lncRNAs and circRNA

This RNA is packaged within extracellular vesicles or protected by MRJP-3 protein into extracellular ribonucleoprotein granules.

(MRJP: major royal jelly protein)

non-coding RNA in royal jelly

MAO (monoamine oxidase): protein responsible for the breakdown of serotonin and dopamine

Methylation rate of MAO promoter is lower (P<0.0001) in S and FS than in NS

MAO protein concentration remains high for many years after

quitting smoking

belangrijke eiwit in context van epigenetica en roken

The study of all biochemical modifications of RNA within a cell

epitranscriptomics

N6-METHYLADENOSINE (M6A) METHYLATION

Most prevalent internal modification in mammalian mRNA

Regulates RNA stability, splicing, and translation

functie M6A methylation

Writers: METTL3, METTL14

Erasers: FTO, ALKBH5

enzymen betrokken bij M6A methylation

TF binding and histone modifications: Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing/qPCR (ChIP–seq/qPCR) detects protein–DNA binding events.

Open chromatin assays : DNase–seq, formaldehyde-assisted identification of regulatory elements (FAIRE–seq) and ATAC-seq.

Chromatin conformation capture (3C, 4C, 5C, Hi-C) : to detect three- dimensional chromatin interactions.

methods to study chromatin

To check which regions have specific histone modifications (or where a TF binds to the genome)

doel ChIP-seq

non-histone ChIP: detect where a certain TF binds to the genome

histone ChIP: detect which genomic loci are associated with modified histones (eg H3K4me3)

twee delen van ChIP-seq

antibodies against TF or histone modification

wat is noodzakelijk voor ChIP-seq?

proteins would be lost when isolating DNA → need cross-linking (eg formaldehyde) to fix proteins to DNA

cruciale eerste stop bij ChIP-seq

ChIP-exo is a method combining ChIP with lambda exonuclease digestion (exo) followed by next-generation sequencing. to reduce noise

ChIP-exo

DNAse-seq

FAIRE-seq

ATAC-seq

drie methodes van open chromatin assays

euchromatin is preferentially cleaved out by Dnase Improved version: CUT&RUN

DNase-seq

phenol-chloroform extraction. The nucleosome-depleted fraction of DNA is preferentially present in the aqueous phase

FAIRE-seq

Use of a hyperactive mutant of Tn5 Transposase

“Tagmentation“: Tn5 transposase simultaneously cleaves and tags double- stranded DNA with sequencing adaptors

→ purified, PCR-amplified, and sequenced using next-generation sequencing

The number of reads for a region correlates with how open that chromatin is

ATAC-seq

To identify and quantify the interactions between genomic loci that are nearby in 3-D space, but may be separated by many nucleotides in the linear genome

chromatin conformation capture (3C)

• Crosslinking met formaldehyde

  • DNA-regio’s die dicht bij elkaar liggen in de 3D-ruimte van de nucleus worden covalent gefixeerd

  • hierdoor blijven chromatine-interacties behouden tijdens de verdere procedure

• Fragmentatie met restrictie-enzymen (RE)

  • het chromatine wordt geknipt in DNA-fragmenten met behulp van restrictie-enzymen

• Proximity ligation met T4 DNA ligase

  • DNA-fragmenten die door crosslinking dicht bij elkaar gehouden worden, worden aan elkaar geligeerd

  • hierdoor ontstaan hybride DNA-fragmenten die oorspronkelijke 3D-interacties representeren

• Reverse crosslinking

  • de crosslinks worden verwijderd

    • typisch met 0.3 M NaCl overnight bij 65°C

  • het geligeerde DNA wordt hierdoor terug vrijgemaakt voor analyse

• Processing en detectie

  • de geligeerde fragmenten worden geanalyseerd via PCR, sequencing of andere downstream technieken om chromatine-interacties te identificeren

Principe:
3C detecteert welke genomische loci fysiek dicht bij elkaar liggen in de nucleus door nabijgelegen DNA-fragmenten eerst te fixeren, vervolgens te ligeren en daarna de gevormde interactieproducten te analyseren

belangrijke stappen bij 3C

Hi-C: combining 3C and next-generation sequencing (NGS) approaches

principe Hi-C

Typically reads short length fragments

typisch aan next generation sequencing

Physical methods to fragment DNA: sonication, shearing

Biochemical methods to fragment DNA: nucleases e.g. Mnase, DNAseI

methodes van DNA fragmentation

Antibody-based technique: e.g. m6A iCLIP (miCLIP)-seq

wat voor technieken worden gebruikt voor het detecteren van epitranscriptomics?

RNA with m6A
Antibody binding on m6A
UV crosslinking to fixate antibody on RNA, to keep the exact position
Isolate RNA + reverse transcription into cDNA
Sequencing

stappen bij miCLIP-seq

• Crosslinking fixeert het antilichaam op het RNA

  • bij miCLIP-seq bindt een antilichaam specifiek aan een RNA-modificatie (bv. m6A)

  • UV-crosslinking fixeert dit antilichaam covalent op het RNA, precies ter hoogte van de gemodificeerde nucleotide

• Ontstaan van een “scar” op het RNA

  • het crosslinked antilichaam vormt een fysische blokkade (“scar”) op het RNA

• Effect op reverse transcriptie

  • tijdens omzetting van RNA naar cDNA wordt reverse transcriptase gehinderd door deze scar

  • dit veroorzaakt:

    • truncatie → reverse transcriptase stopt vroegtijdig

    • of mutaties → bv. nucleotideveranderingen zoals C→T transities

• Detectie van RNA-modificaties

  • deze truncaties of mutaties laten toe om de exacte positie van RNA-modificaties met hoge resolutie te bepalen na sequencing

Principe:
Bij miCLIP-seq zorgt UV-crosslinking van een antilichaam aan gemodificeerd RNA voor een “scar” die reverse transcriptie verstoort. De resulterende truncaties of mutaties worden gebruikt om RNA-modificaties zoals m6A nauwkeurig in kaart te brengen.

effect crosslinking bij miCLIP-seq

MDA: multiple displacement amplification

methode voor DNA amplificiation bij single cell sequencing

dCas9-sgRNA complexes can be fused to epigenetic enzymes

dCas9 = endonuclease deficient Cas9, is a mutant form of Cas9

Cas-systeem voor epigenetic editing