intro, prueba 1

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Cromosomas

Empaquetamiento del ADN con proteínas histonas

Mutaciones

Cambios en la secuencia del ADN, pueden ser:

missense: cambio de base genera un codon que codifica para un aminoácido distinto

nonsense: cambio de base detiene la lectura del gen

Réplicacion

Hebra original se separa formando dos hebras que sirven como moldes para la creación de nuevo ADN, compuesto por una hebra molde y una vieja

Denaturacion y renaturacion

Denaruracion: destructuración del ADN por ruptura de puentes de hidrógeno entre bases, se induce por calor

Renaturacion: reestructuración del ADN, hebras se “encuentran” y forman puentes de hidrógeno, volviendo a unirse

Colinearidad gen proteína

Orden de los nucleotidos en el ADN y el ARNm corresponde con el orden de los aminoácidos en una proteína

Estructura del gen

Un gen no es óleo la secuencia que codifica para aminoácidos, también contiene secciones reguladoras, promotores, etc

Elementos reguladores

Cis: son parte de la molécula de ADN que regulan, permanentes pero de accesibilidad variable

Trans: ajena a la molécula de ADN que regulan, su disponibilidad y abundancia está regulada

Dogma central de la biología molecular

Describe el flujo de información genética:

ADN se transcribe a ARN que se traduce a proteína

transcripción

proceso mediante el cual se sintetizan hebras de ARNm a partir de ADN

etapas de la traducción

iniciación: donde la maquinaria de transcripción liderada por ARN polimerasa reconoce una región en el ADN en conjunto con proteínas accesorias

elongacion: se forma la burbuja transcripcional y la ARN polimerasa comienza a generar la hebra de ARN

terminación: ARN polimerasa pierda la unión al ADN y el ARN pre maduro es liberado

edición del ARNm

el ARN pre maduro es editado mediante splicing, proceso que remueve intrones y empalma exones. El ARNm maduro es posteriormente utilizado para la síntesis de proteínas

traducción

proceso mediante el cual se generan proteínas a partir de la información de los ARNm

Hipótesis del adaptador de Crick

Crick propuso la existencia de una molécula adaptadora que reconoce un codon y le asocia un aminoácido. Hoy en día conocemos esto como el ARNt

Código genético

Es la correspondencia de uno o más tripletes de ADN/ARN a una aminoácido específico. es:

Degenerado: hay tripletes distintos que codifican para el mismo aminoácido

Universal: el mismo para todos los organismos

No ambiguo: cada triplete o codon codifica para un solo aminoácido

PCR

Proceso que permite amplificar una secuencia de ADN específica y rápidamente a través de poco material.

Proceso del PCR

Desnaturalización (94º): hebras simples se separan con calor (ruptura de puentes de H)

Unión de primers (55º): cadena corta complementaria a la región específica de ADN amplificar. Se une para indicar a la taq polimerasa donde empezar a sintetizar la hebra (otorga especificidad)

Extensión (72º): taq polimerasa sintetiza nuevas hebras de ADN

Taq polimerasa

Polimerasa de Thermus aquaticus una bacteria que vive a altas temperaturas, puede sobrevivir varios ciclos de replicacion

Visualización de PCR

Por electroforesis en gel de agarosa que separa fragmentos de ADN por tamaño usando campo eléctrico. Dado que el ADN es negativo migra al polo positivo y los fragmentos pequeños se mueven más arriba

Secuenciacion de ADN por método Sanger

Se basa en la mezcla de desoxirribonucleotidos con didesoxirribonucleotidos estos tienen un hidrógeno en vez de un grupo hidroxilo lo que permite que se unan a la cadena mediante su fosfato pero no la puedan continuar. Viendo como la cadena se detiene aleatoriamente en varias cadenas y repitiendo con las 4 bases puede revelar las posiciones de estas

Lectura de Sanger

Por electroforesis capilar fluorescente: utilizando un carril con marcadores fluoroforos de 4 colores que marcan cada base. Un software puede leer esta lámina con precisión

Antes se hacía a mano, con fósforo radioactivo y en 4 carriles paralelos

Shotgun sequencing

se fragmenta el genoma en pedazos pequeños, se secuencian por separado y se unen con un software

paired end sequencing

refinamiento del shotgun sequencing. El genoma se fragmenta al azar en pedazos pequeños pero se leen desde los dos extremos para unirlos mejor (con un software)

next generation sequencing

permite leer millones de fragmentos rápidamente.

1) se fragmenta el ADN

2)Se amplifican los fragmentos

3) se secuencian los fragmentos

4) las secuencias se ensamblan con un software

Tipos de NGS

illumina: cada nucleotido emite una señal fluorescente que se registra para ensamblar la secuencia

ion torrent: nucleotidos liberan H+ y se detectan los cambios de pH para secuenciar

oxford nanopore: ADN pasa por un poro, cambiando la corriente eléctrica y permitiendo identificar bases

Post secuenciación NGS

se generan archivos FASTQ con muchas lecturas cortas que con un software se seleccionan y ensamblan. Puede también identificar variantes en un genoma comparando con otro de referencia

Tipos de variantes genéticas

polimorfismos de neuclotido único (SNP: cambio de una sola base, son muy frecuentes. Son las mutaciones más comunes

Inserciones y deleciones (Indels): adición o delecion de pares de bases, pueden alterar el marco de lectura

Variantes estructurales: reordenamientos mayores como inversiones y translocaciones afectan grandes segmentos cromosómicos

Secuenciaciones de ADN

WGS (whole genome sequencing): todo el genoma

WES (whole exome sequencing): solo un pequeño porcentaje codificante

paneles dirigidos: genes seleccionados por relevancia clínica

secuenciaciones de ARN

transcriptoma: captura genes activos en un momento y tejido específico

expresión diferencial: compara perfiles de expresión entre condiciones

splicing alternativo: detecta isoformas de ARNm y eventos de splicing alterado

aplicaciones de NGS

medicina personalizada: identificación de mutaciones

enfermedades raras: permiten diagnosticarlas

investigación: para caracterizar comunidades microbianas

interpretación de secuenciación

varias variables son de efecto neutro. VUS (variantes de significado incierto) son aquellas que carecen de evidencia para caracterizarlas como patogenas o benignass de

Tecnología de ADN recombinante

permite combinar el ADN de diferentes organismos

Expresión heterologa

expresión de un gen propio de un organismo en otro que no lo poseía originalmente

proceso de ADN recombinante

1) Se corta tanto el gen de interés como el vector (plasmido)

2) se inserta el gen en el plasmido

3) extremos cortados se unen utilizando ligasa, uniendo el fragmento de ADN al vector

4) plasmido se ingresa a la bacteria y esta replica este ADN

5) se seleccionan bacterias que contienen el gen deseado

6) se replican bacterias con el gen deseado

enzimas de restricción

endonucleasas que reconocen secuencias específicas de ADN y cortan el enlace fosfodiester que las une. Pueden forman

Extremos romo: cortan el mismo punto en ambas hebras, estas no pueden volverse a encontrar

Extremos cohesivos: dejan extremos que pueden interactuar por puentes de hidrógeno

selección de enzimas de restricción

para conocer las enzimas de restricción que tiene un plasmido suelen existir mapas de estos. De lo contrario puede secuenciarse o hacer una restricción diagnóstica usando distintas enzimas para ver donde cortan y que fragmentos generan

Mecanismos de selección en ADN recombinante

para seleccionar solo bacterias que contengan el plasmido con el gen insertado puede añadirse también un plasmido de resistencia a antibióticos y ver que bacterias sobreviven un cultivo con estos

mutagenesis sitio dirigida

tecnología que permite realizar un cambio específico y dirigido en una secuencia de ADN dentro de un plasmido. In vitro

Proceso de mutagenesis sitio dirigida

1) se diseña partidor: fragmento corto de ADN que se une a una secuencia específica y contiene el cambio que se quiere expresar

2) se desnatura la hebra que contendrá el primer

3) partidor/primer se une al plasmido por complementariedad de bases

4)plasmido se amplifica por PCR

5) se generan plasmidios con la secuencia deseada

CRISPR/Cas9

sistema de edición genética específica y dirigida in vivo

CRISPR/Cas9 en bacterias

En el genoma de una bacteria hay secuencias palindromicas seguidas por espaciadores (ADN viral) que la bacteria inserta en su ADN

Se ensambla complejo que contiene la proteína cas9 (endonucleasa) cARN( activa cas9) y tracrARN(detecta secuencia en el virus)

CRISPR/Cas9

cARN y tracrARN se unen un ARN guía artificial que dirige a Cas9 a una secuencia

1) gARN se unen por complementariedad

2)Cas9 corta ambas hebras

3) se introduce ADN donante y se realiza reparación dirigida por homologia

CRISPR/ Cas9 para regular genes

gARN guía Cas9 al promotor de un gen. Este se encuentra fusionado con un activador que recluta ARN polimerasa y factores de transcripción para aumentar la expresión de un gen

consideraciones éticas del uso de CRISPR/Cas 9

cambios genéticos son heredables

especificidad

seguridad

eugenesia

métodos omicos

aquellos que caracterizan el conjunto completo de moléculas biológicas en un sistema:

ej: genomica, trancriptomica, proteomica, metabolomica

transcriptomica

conjunto de todos los ARNm expresados por una célula o población de estas. Este puede variar con las condiciones ambientales o la identidad celular

genomica funcional

estudio de todos los genes expresados por una célula o conjunto de estas en respuesta a agentes externos o internos

patrones de expresión: cuándo y cómo se expresan los genes

expresión diferencial: bajo qué circunstancias se expresan

perfiles de expresión: asociados a las vías metabólicas y como los componentes celulares llevan a cabo distintos procesos

análisis transcriptomicos

mediante:

microarreglos

NGS: ARN sequencing