Metode DNK Izolacije - Practice Flashcards

Flashkartice pokrivaju osnovne koncepte, metode i korake u izolaciji DNK i RNK prema predavanju Doc.dr. Rijada Konjhodžića.

DNK ekstrakcija

Proces odvajanja i purifikacije DNK od ćelijske membrane, proteina i drugih ćelijskih komponenti koristeći fizičke i/ili hemijske metode.

Biološki uzorci za izolaciju

Krv, brisevi (bukalne sluznice, cervikalni), tkivo, feces, amnionska tečnost, dlaka, kost.

Cilj izolacije DNK

Dobiti čistu DNK u dovoljnoj količini koja je pogodna za daljnju analizu.

Hemijske metode ekstrakcije

Dijele se na organske (fenol-hloroform) i neorganske (ekstrakcija proteinazom K, metoda isoljavanja, metoda spin kolumnica).

Fizičke metode ekstrakcije

Ekstrakcija magnetnim partikulama i ekstrakcija papirom (paper-based DNA extraction).

Liza ćelije

Prvi korak izolacije koji podrazumijeva razbijanje ćelijskih zidova/membrana i jedra radi oslobađanja sadržaja ćelije pomoću deterdženata, enzima, zagrijavanja ili mehanički.

Proteinaza K

Ključni enzim koji razgrađuje proteine (histone, enzime) i deaktivira nukleaze tokom izolacije DNK.

Precipitacija

Taloženje ili odvajanje oslobođene DNK molekule od drugih ćelijskih molekula, najčešće koristeći etanol ili izopropanol.

Purifikacija

Čišćenje DNK molekule od proteina, soli, deterdženata i PCR inhibitora.

Kolekcija/elucija

Prikupljanje prečišćene DNK rastvaranjem u odgovarajućem volumenu, najčešće koristeći TE pufer ili sterilnu vodu.

Fenol-hloroform ekstrakcija

Metoda u kojoj fenol-hloroform izdvaja proteine i lipide u donju organsku fazu, dok DNK ostaje u gornjoj vodenoj fazi.

Nedostaci fenol-hloroform metode

Korištenje agresivnih i toksičnih hemikalija, rizik od kontaminacije fenolom koji inhibira PCR, te duga i zahtjevna procedura.

Metoda isoljavanja (Salting-out)

Metoda bazirana na dehidraciji i taloženju proteina u zasićenoj otopini $NaCl$, nakon čega DNK ostaje u supernatantu.

Princip silica-membrane metode

Vezanje negativno naelektrisane DNK za negativno naelektrisanu silika-membranu putem "mosta" od soli u prisustvu kaotropne soli.

Binding buffer

Rastvor koji sadrži visoku koncentraciju kaotropne soli ($pH \text{ } 5-6$) koja narušava hidrogenove veze i omogućava vezanje DNK za silika-membranu.

Automatska ekstrakcija

Izolacija nukleinskih kiselina pomoću instrumenata (najčešće magnetne perle ili silika tehnologija) čime se smanjuje ljudska greška i rizik od kontaminacije.

Specifičnosti RNK izolacije

RNK je nestabilnija od DNK, lako se razgrađuje RNazama i zahtijeva prevođenje u cDNK odmah nakon ekstrakcije.