Eiwit Karakterisatie - Hoofdstuk 5

Oefenkaarten gebaseerd op de lecture notes over eiwit karakterisatie, inclusief antilichamen, concentratiebepalingen, elektroforese, ELISA en fluorescentie technieken.

Wat is het fundamentele verschil tussen een immunogeen en een antigeen?

Alle immunogenen zijn antigenen omdat ze herkend worden door het immuunsysteem, maar niet alle antigenen zijn immunogenen; enkel immunogenen kunnen daadwerkelijk een immuunrespons veroorzaken.

Uit welke specifieke ketens en verbindingen is een humaan IgG-antilichaam opgebouwd?

Het bestaat uit 2 identieke lichte ketens (met 2 domeinen elk) en 2 identieke zware ketens (met 4 domeinen elk), die aan elkaar zijn verbonden via zwavelbruggen.

Welk antilichaamisotype wordt als eerste geproduceerd bij een infectie en komt voor als een pentameer?

IgM

Wat is een belangrijk nadeel van polyclonale antilichamen (pAb) vergeleken met monoclonale antilichamen (mAb)?

Er is een beperkte voorraad (serum op = pAb op), er is nood aan nieuwe immunisaties van dieren en er is sprake van variabiliteit tussen batches.

Formuleer de Wet van Beer die gebruikt wordt bij UV-spectrofotometrie voor concentratiebepaling.

$A = \epsilon \times c \times l$, waarbij $A$ de absorbantie is, $\epsilon$ de extinctieco'f'fici'ebnt, $c$ de concentratie en $l$ de lengte van het optische pad.

Welke aminozuren zijn primair verantwoordelijk voor de UV-absorptie van eiwitten op $280\,nm$?

Tyrosine (Y) en Tryptofaan (W).

Wat is de theoretische $A_{260}/A_{280}$ ratio voor zuiver DNA?

$$1.8$$

Hoe werkt de Bradford-assay voor indirecte eiwitbepaling?

Het maakt gebruik van Coomassie brilliant blue (CBB) dat bindt aan eiwitten (voornamelijk arginine); de maximale absorptie verschuift hierbij van $465\,nm$ naar $595\,nm$.

Wat is de functie van de Kjeldahl-methode bij eiwitkarakterisatie?

Het is een methode voor absolute kwantificatie die het gehalte aan stikstof (N) bepaalt om de massa van een substantie te berekenen.

Waarom wordt SDS (sodium dodecyl sulfaat) toegevoegd bij SDS-PAGE?

Om eiwitten te denatureren en ze een uniforme negatieve lading te geven die recht evenredig is aan de grootte van het eiwit.

Welk agens is specifiek nodig om zwavelbruggen in eiwitten te verbreken tijdens SDS-PAGE?

Een reducerend agens zoals betamercaptoethanol.

Wat is de definitie van het isoelektrisch punt (pI) van een eiwit?

De pH-waarde waarbij de netto lading van het eiwit nul is en het niet langer migreert in een elektrisch veld.

Welke twee technieken worden gecombineerd bij 2D-elektroforese?

Isoelectrisch focussing (scheiding op lading) en SDS-PAGE (scheiding op grootte).

Beschrijf het principe van een Sandwich ELISA.

Een wel wordt gecoat met een capture-antilichaam dat het antigeen bindt, waarna een primair detectie-antilichaam en vervolgens een enzym-gekoppeld secundair antilichaam (of biotine-streptavidine systeem) worden toegevoegd voor signaalvorming.

Wat vertelt de $EC_{50}$ waarde ons in de context van een ELISA-bindingstest?

Het staat voor de 'effective concentration' waarbij $50\,\%$ van het maximale effect (binding) wordt bereikt; het is een maat voor de affiniteit.

Wat is de Stokes shift bij fluorescentie?

Het verschijnsel waarbij de emissiegolflengte altijd langer (lager qua energie) is dan de excitatiegolflengte.

Waarvoor worden 'forward scatter' (FSC) en 'side scatter' (SSC) gebruikt in flowcytometrie?

FSC geeft informatie over de grootte van de cel, terwijl SSC informatie geeft over de granulariteit van de cel.

Wat is het werkingsmechanisme van fluorescentie quenching via een enzymatische linker?

Een quencher absorbeert de energie van een fluorofoor door nabijheid; wanneer een enzym de peptide-linker tussen beide verbreekt, neemt de afstand toe en wordt het fluorescente signaal meetbaar.

Wat is de maximale afstand tussen een donor en acceptor voor een succesvolle FRET-meting?

Kleiner dan $10\,nm$.

Wie ontvingen de Nobelprijs voor de ontdekking en ontwikkeling van het Green Fluorescent Protein (GFP)?

Shimomura, Chalfie en Tsien (2008).

Wat is het belangrijkste verschil in signaalopwekking tussen fluorescentie en bioluminescentie?

Bij fluorescentie wordt het signaal opgewekt door invallend licht (excitatie), terwijl bij bioluminescentie het signaal wordt opgewekt door een chemische reactie (bv. luciferase en D-luciferine).

Welke parameters kunnen specifiek worden bepaald met Surface Plasmon Resonance (SPR)?

De bindingskinetiek, bestaande uit de associatiesnelheid ($k_a$) en de dissociatiesnelheid ($k_d$), evenals de affiniteit ($K_D$).