🌱🦠 Mikrobiologia - 🔬🧫 Laby - 🔬💡 Mikroskopowanie cz. 2

🧪🔬 Preparaty przyżyciowe (niewybarwione) oraz preparaty utrwalone i barwione (martwe).

❓📋 Jakie dwa główne rodzaje preparatów stosuje się w mikroskopii optycznej?

🏃‍♂📐 Zdolność ruchu oraz rzeczywisty kształt.

Pozwalają one obserwować bakterie żywe, niezmienione przez czynniki chemiczne (utrwalacze, barwniki), które mogą obkurczać komórki.

❓👀 Co przede wszystkim pozwala ocenić obserwacja preparatów przyżyciowych (niewybarwionych)?

🌫📉 Bardzo mały kontrast.

Współczynnik załamania światła komórki jest zbliżony do otoczenia (wody/pożywki), przez co bakterie są słabo widoczne w jasnym polu.

❓⚠ Jaka jest główna wada obserwacji preparatów niewybarwionych w mikroskopie jasnego pola?

💧🔨 Kropla spłaszczona (płyn między szkiełkiem podstawowym a nakrywkowym)

oraz kropla wisząca (kropla zawieszona na szkiełku nakrywkowym nad wgłębieniem w szkiełku podstawowym).

❓🍬 Jakie są dwie techniki wykonywania preparatów przyżyciowych?

🌗🌓 Kontrast fazowy lub ciemne pole.

Techniki te sztucznie zwiększają kontrast, czyniąc przezroczyste bakterie widocznymi bez barwienia.

❓🔬 Jakich technik mikroskopowych najlepiej używać do obserwacji preparatów przyżyciowych, aby poprawić ich widoczność?

🎨☠ Ułatwienie obserwacji (zwiększenie kontrastu) oraz różnicowanie.

Barwienie pozwala odróżnić grupy bakterii (np. Gram-dodatnie od Gram-ujemnych) oraz uwidocznić struktury (przetrwalniki, otoczki), ale wiąże się z zabiciem komórek.

❓🌈 Jaki jest cel stosowania preparatów barwionych, mimo że proces ten zabija bakterie?

🛢🔍 Obiektywu immersyjnego (100x).

Daje on powiększenie rzędu 1000x, co jest niezbędne do dokładnej oceny morfologii bakterii w preparatach barwionych.

❓🔭 Jakiego obiektywu używa się standardowo do oglądania utrwalonych preparatów bakteryjnych?

📏🦠 Mikrometr okularowy.

Jest to szklana płytka z podziałką umieszczona w okularze, którą należy wcześniej wycechować (skalibrować) za pomocą mikrometru przedmiotowego.

❓📐 Co służy do pomiaru wielkości komórek pod mikroskopem?

➕🧪 Barwienie pozytywne.

Polega na zabarwieniu komórek mikroorganizmów, które stają się widoczne na niezabarwionym (jasnym) tle.

❓🎨 Jak nazywa się typ barwienia, w którym barwnik łączy się trwale z komórką, czyniąc ją ciemniejszą od tła?

➖🌑 Barwienie negatywne.

Polega na zabarwieniu tła, podczas gdy komórki pozostają niezabarwione (jasne). Umożliwia to obserwację kształtu i otoczek bez ingerencji w strukturę komórki.

❓🌃 Na czym polega barwienie negatywne i jak wyglądają w nim komórki?

🧪⚡ Barwniki zasadowe.

Są to sole, w których kolorowy kation (+) wiąże się z ujemnie naładowanymi składnikami komórki (kwasy nukleinowe, ściana komórkowa) na zasadzie przyciągania elektrostatycznego.

❓➕ Jaki rodzaj barwników (kwasowe czy zasadowe) stosuje się najczęściej do barwienia pozytywnego bakterii i dlaczego?

💙💜 Błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fuksyna zasadowa.

❓🧪 Wymień trzy przykłady popularnych barwników zasadowych stosowanych w mikrobiologii.

🧪⛔ Barwniki kwasowe.

Posiadają kolorowy anion (-), który jest odpychany przez ujemnie naładowaną powierzchnię bakterii, dzięki czemu barwią tło, a nie komórki.

❓➖ Jakie barwniki (o jakim ładunku) stosuje się w barwieniu negatywnym?

⚫🔴 Nigrozyna, eozyna, czerwień kongo, tusz chiński.

❓🎨 Podaj przykłady barwników stosowanych do barwienia negatywnego.

👆🖌 Barwienie proste.

Używa się w nim tylko jednego barwnika. Pozwala ocenić kształt i układ komórek, ale nie różnicuje ich struktury.

❓1⃣ Jak nazywa się technika, w której na utrwalony preparat nanosi się tylko jeden barwnik (np. błękit metylenowy)?

🔢🌈 Barwienie złożone.

Wykorzystuje co najmniej dwa barwniki (podstawowy i kontrastowy) w określonej kolejności. Przykładem jest barwienie metodą Grama.

❓🎨 Jak nazywa się technika wykorzystująca kolejno kilka odczynników, pozwalająca różnicować grupy bakterii?

👨‍🔬 Christian Gram (w 1884 roku).

❓📜 Kto opracował najważniejszą w bakteriologii metodę barwienia różnicującego?

🧱🛡 Budową ściany komórkowej.

Bakterie Gram-dodatnie mają grubą warstwę peptydoglikanu, a Gram-ujemne cienką warstwę i zewnętrzną błonę lipidową.

❓🔬 Czym różnią się bakterie Gram-dodatnie od Gram-ujemnych, co jest podstawą wyniku barwienia Grama?

💜🟣 Fiolet krystaliczny (barwnik podstawowy) – barwi wszystkie komórki na fioletowo,

Jodek potasu w jodzie (Płyn Lugola) – zaprawa, tworzy kompleksy z fioletem.

❓🧪 Jakie są dwa pierwsze odczynniki w metodzie Grama i jaka jest ich rola?

🍶🚿 Alkohol (etanol) lub aceton.

Wypłukuje on kompleks fioletu z bakterii Gram-ujemnych (odbarwia je), podczas gdy w Gram-dodatnich barwnik pozostaje uwięziony w grubej ścianie.

❓🧼 Co jest kluczowym etapem różnicującym w metodzie Grama (etap 3) i jaki odczynnik się stosuje?

🌸🔴 Fuksyna zasadowa (lub safranina).

Barwi ona na różowo odbarwione wcześniej komórki Gram-ujemne.

❓🖌 Jaki barwnik kontrastowy (dobarwiający) stosuje się na końcu metody Grama?

🟣🆚🔴 Gram-dodatnie: Fioletowe/Granatowe.

Gram-ujemne: Różowe/Czerwone.

❓👀 Jaki kolor mają ostatecznie bakterie Gram(+) a jaki Gram(-) w obrazie mikroskopowym?

🕯🧬 Barwienie metodą Ziehl-Neelsena.

Stosuje się je do bakterii kwasoopornych (np. Mycobacterium), które mają w ścianie dużo wosków i mykolowych kwasów tłuszczowych.

❓🔥 Jaka inna metoda barwienia złożonego (wymagająca użycia wysokiej temperatury) jest stosowana do wykrywania prątków gruźlicy?

🌿✨ Autofluorescencja.

Niektóre związki wewnątrzkomórkowe (np. chlorofile, bakteriochlorofile) naturalnie emitują światło po wzbudzeniu, co pozwala na identyfikację bakterii fotosyntetyzujących bez barwienia.

❓🔬 Jak nazywa się zjawisko naturalnego świecenia komórek bakteryjnych i jakie barwniki za to odpowiadają?

🧬🔵 DAPI oraz oranż akrydyny.

Wiążą się one z kwasami nukleinowymi (DNA/RNA). DAPI fluoryzuje na niebiesko.

❓🧪 Wymień przykłady fluorochromów (barwników) wiążących się z DNA, stosowanych do uwidaczniania nukleoidów.

🛡🔦 Immunofluorescencja.

Wykorzystuje się w niej przeciwciała znakowane fluorochromami, które specyficznie wiążą się z antygenami na powierzchni określonych bakterii.

❓💉 Jak nazywa się technika pozwalająca na identyfikację konkretnego gatunku bakterii za pomocą znakowanych przeciwciał?

🧬🔍 Sondy molekularne (hybrydyzacja in situ / FISH).

Są to krótkie fragmenty DNA/RNA oznakowane barwnikiem, które łączą się z komplementarnymi sekwencjami w materiale genetycznym bakterii.

❓🧩 Jaka metoda pozwala na identyfikację bakterii na podstawie ich sekwencji genetycznych bezpośrednio pod mikroskopem?

🟢🐸 Białko GFP (Green Fluorescent Protein).

Gen kodujący to białko łączy się z genem badanego białka bakteryjnego (tworząc białko fuzyjne), co pozwala śledzić jego lokalizację w żywej komórce.

❓🧬 Jakie białko (pochodzące z meduzy) jest powszechnie stosowane w inżynierii genetycznej do śledzenia ekspresji genów i lokalizacji białek?

📏🍰 Przekroje optyczne (ang. optical sections).

Mikroskop konfokalny pozwala uzyskać ostre obrazy z różnych głębokości preparatu bez konieczności jego fizycznego krojenia.

❓🔪 Jaki rodzaj obrazowania, eliminujący potrzebę fizycznego cięcia próbki, umożliwia mikroskop konfokalny?

🏗🦠 Struktura biofilmów.

Dzięki możliwości rekonstrukcji trójwymiarowej (3D), mikroskopia konfokalna jest idealna do badania przestrzennej organizacji grubych warstw bakteryjnych.

❓🧱 Do badania jakich złożonych struktur bakteryjnych (często grubych i przestrzennych) szczególnie przydaje się mikroskopia konfokalna?

☠🆚😊 Ocenę żywotności komórek (Live/Dead).

Stosując odpowiednie zestawy barwników, można odróżnić komórki żywe (zielone) od martwych (czerwone) na podstawie ciągłości ich błon komórkowych.

❓🚦 Co (poza identyfikacją) umożliwiają nowoczesne zestawy barwników fluorescencyjnych w badaniu populacji bakterii?

🧬🔵 DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol).

Cząsteczki tego barwnika wiążą się trwale z dwuniciowym DNA, uwidaczniając wszystkie komórki w preparacie.

❓🧪 Jaki popularny fluorochrom stosuje się do uwidocznienia wszystkich mikroorganizmów w próbce poprzez wybarwienie ich materiału genetycznego?

🌊🔢 Metoda filtrów membranowych.

Przesącza się określoną objętość wody przez czarny filtr, barwi osadzone bakterie DAPI, a następnie liczy świecące komórki w polach widzenia mikroskopu.

❓🔬 W jaki sposób wykorzystuje się DAPI do określania liczby bakterii w próbkach środowiskowych (np. w wodzie z jeziora)?

🚦💀 LIVE/DEAD BacLight™.

Pozwala on na rozróżnienie w preparacie komórek żywych i martwych.

❓🧟 Jak nazywa się komercyjny zestaw barwników umożliwiający ocenę żywotności komórek bakteryjnych?

🛡🧱 Ciągłość błony komórkowej.

SYTO 9 (zielony) wnika do wszystkich komórek, natomiast jodek propidyny (czerwony) wnika tylko do komórek z uszkodzoną błoną (martwych).

❓🧬 Na jakiej cesze fizjologicznej komórki opiera się działanie zestawu LIVE/DEAD?

🟢🔴 Żywe: Zielona fluorescencja (SYTO 9).

Martwe: Czerwona fluorescencja (jodek propidyny wypiera/tłumi SYTO 9).

❓🎨 Jaki kolor w obrazie mikroskopowym mają komórki żywe, a jaki martwe po zastosowaniu zestawu LIVE/DEAD?

💉🔍 Immunofluorescencja.

Wykorzystuje ona specyficzne przeciwciała znakowane fluorescencyjnie, które wiążą się z antygenami konkretnego patogenu.

❓🛡 Jaka metoda pozwala na wykrycie określonego gatunku bakterii (np. patogenu) bezpośrednio w materiale od pacjenta, bez konieczności hodowli?

⚡🏥 Szybkość diagnozy.

Metoda ta umożliwia postawienie diagnozy (np. w przypadku legionellozy czy wąglika) bezpośrednio z próbki, pomijając czasochłonny etap namnażania bakterii.

❓⏱ Jaka jest główna zaleta diagnostyczna metody immunofluorescencji w porównaniu do tradycyjnych metod hodowlanych?

🟢🧬 Białko fuzyjne.

Powstaje ono przez połączenie genu kodującego badane białko z genem kodującym GFP (zielone białko fluorescencyjne). Pozwala to śledzić lokalizację białka w żywej komórce.

❓🧩 Co tworzy się w inżynierii genetycznej, aby wyznakować konkretne białko wewnątrz komórki przy użyciu GFP?

🐟🧬 FISH (ang. Fluorescence In Situ Hybridization).

Czyli fluorescencyjna hybrydyzacja in situ.

❓🎣 Jakim skrótem określa się metodę wykorzystującą sondy genetyczne do wykrywania mikroorganizmów bezpośrednio w preparacie?

🦠🌑 Mikroorganizmy niehodowalne.

Dzięki FISH można wykrywać i identyfikować gatunki, których nie potrafimy namnożyć na pożywkach w laboratorium.

❓🧫 Jaką grupę mikroorganizmów, trudną do zbadania klasycznymi metodami, pozwala wykryć technika FISH?

🧬🎯 rRNA (rybosomowy RNA),

najczęściej 16S rRNA u prokariotów. Zawiera on sekwencje charakterystyczne dla różnych poziomów taksonomicznych.

❓🎯 Co jest najczęstszym celem molekularnym (matrycą), z którym wiąże się sonda w technice FISH u bakterii?

🧪🔗 Sonda (oligonukleotydowa).

Jest to krótki fragment DNA komplementarny do poszukiwanej sekwencji RNA, sprzężony z barwnikiem fluorescencyjnym.

❓🔌 Jak nazywa się krótki odcinek DNA połączony z fluorochromem, który w technice FISH odnajduje specyficzną sekwencję w komórce?

🛁🚿 Musi zostać przepuszczona przez błonę.

Komórki traktuje się odpowiednimi odczynnikami (permeabilizacja), aby ich błony stały się przepuszczalne dla sondy, która wchodzi do środka i hybrydyzuje z rRNA.

❓🚪 Co musi się stać z błoną komórkową bakterii, aby sonda FISH mogła zadziałać?

🏗🏙 Lokalizację przestrzenną w złożonych strukturach (np. biofilmach, osadach ściekowych) oraz badanie różnorodności w zespołach.

❓🌍 Co umożliwia technika FISH (zwłaszcza w połączeniu z mikroskopią konfokalną) w badaniu naturalnych zespołów mikroorganizmów?

🐟🧬 Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

(ang. Fluorescence In Situ Hybridization).

❓🧪 Co oznacza skrót FISH?

🦠👻 Mikroorganizmy niehodowalne.

Metoda ta pozwala wykrywać gatunki, których nie udaje się namnożyć na pożywkach laboratoryjnych.

❓🧫 Jaka jest główna zaleta metody FISH w porównaniu do klasycznych metod mikrobiologicznych?

🎯📉 Małe rybosomowe RNA (16S rRNA).

Cząsteczki te zawierają sekwencje nukleotydowe specyficzne dla każdego poziomu taksonomicznego (od domeny aż po gatunek).

❓🧬 Jaka cząsteczka wewnątrz komórki prokariotycznej jest najczęstszym celem (matrycą), z którym wiążą się sondy w technice FISH?

🧪🔌 Sonda (oligonukleotydowa).

Jest to krótki łańcuch nukleotydów, komplementarny do charakterystycznej sekwencji danego taksonu, sprzężony z barwnikiem fluorescencyjnym.

❓🔍 Jak nazywa się narzędzie molekularne używane w FISH, które fizycznie odnajduje i znakuje bakterie?

🔓🚪 Permeabilizacja błon.

Błony komórkowe muszą stać się przepuszczalne, aby sonda mogła wniknąć do wnętrza komórki i połączyć się z rybosomami.

❓🛁 Jaki proces musi zajść w utrwalonych komórkach przed dodaniem sondy, aby metoda zadziałała?

🧩🔗 Hybrydyzacja.

Sonda łączy się z komplementarną sekwencją rRNA wewnątrz komórki.

❓🤝 Jak nazywa się proces wiązania sondy z materiałem genetycznym bakterii?

🚿🔦 Odpłukanie.

Należy usunąć sondy, które się nie związały, aby w mikroskopie świeciły tylko komórki zawierające poszukiwaną sekwencję.

❓🧹 Co należy zrobić po etapie hybrydyzacji, zanim obejrzy się preparat pod mikroskopem?

🎨👯‍♀ Różne barwniki fluorescencyjne.

Stosując różne sondy sprzężone z różnymi barwnikami, można w jednym preparacie odróżnić od siebie różne grupy mikroorganizmów.

❓🌈 W jaki sposób technika FISH pozwala na jednoczesną identyfikację kilku różnych gatunków bakterii w tej samej próbce?

🏥⚡ Szybka identyfikacja patogenów.

Umożliwia wykrycie patogenu bezpośrednio w materiale od pacjenta (np. krew), bez konieczności czasochłonnej hodowli, co pozwala na szybkie wdrożenie leczenia.

❓🩺 Dlaczego technika FISH jest cenna w diagnostyce medycznej?

🏗🏙 Lokalizację przestrzenną w złożonych strukturach (np. biofilmach, osadach ściekowych).

Najlepiej w połączeniu z mikroskopem konfokalnym.

❓🌍 Co umożliwia badanie techniką FISH w kontekście ekologii drobnoustrojów i złożonych zespołów (np. w osadach ściekowych)?

🏗🧱 Biofilmy oraz maty mikroorganizmów.

Mikroskop konfokalny jest niezbędny do zobrazowania ich złożonej, przestrzennej struktury.

❓🔬 Do badania jakich wielogatunkowych struktur bakteryjnych mikroskopia konfokalna jest narzędziem pierwszego wyboru?

📚🍰 Ze stosu obrazów (skrawków optycznych).

Mikroskop wykonuje zdjęcia poszczególnych warstw, z których następnie rekonstruuje się trójwymiarowy obraz (3D) pokazujący ukształtowanie powierzchni i grubość.

❓🖼 W jaki sposób powstaje trójwymiarowy obraz biofilmu w mikroskopie konfokalnym?

🐟🗺 Określenie przynależności systematycznej.

Pozwala zobaczyć, które gatunki tworzą daną strukturę i jak są rozmieszczone względem siebie w macie.

❓🤔 Co wnosi zastosowanie techniki FISH (oprócz samego obrazowania struktury) do badania mat mikroorganizmów?

🦠💡 Jako świecące punkty.

Mimo że wirusy są mniejsze niż zdolność rozdzielcza mikroskopu, fluorochromy sprawiają, że stają się widoczne jako źródła światła (choć nie widać ich kształtu).

❓👀 W jakiej postaci widoczne są wirusy w mikroskopie fluorescencyjnym?

🧬🧪 DAPI, Hoechst, SYBR Green.

Są to barwniki wykazujące powinowactwo do kwasów nukleinowych.

❓🎨 Jakie barwniki stosuje się do uwidaczniania wirusów w mikroskopii fluorescencyjnej?

🔢✅ Liczenie cząstek wirusowych

oraz potwierdzenie ich obecności w próbce.

❓📊 Co można zbadać u wirusów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, mimo braku widoczności ich morfologii?

🚧🚀 Przekroczenie limitu dyfrakcyjnego.

Limit ten ograniczał klasyczną mikroskopię optyczną do rozdzielczości ok. 0,25 µm.

❓🛑 Jaka jest fundamentalna zaleta technik wysokorozdzielczych (ang. super resolution fluorescence microscopy)?

🔟✨ Około 10-krotnie.

Pozwala to na znacznie dokładniejsze obrazowanie niż w przypadku zwykłych mikroskopów.

❓📈 O ile lepszą zdolność rozdzielczą (w przybliżeniu) oferują mikroskopy wysokorozdzielcze w porównaniu do klasycznych?

🧬🔍 Struktury wewnątrzkomórkowe prokariotów.

Wcześniej były one słabo widoczne lub niewidoczne w mikroskopii świetlnej.

❓🦠 Co stało się możliwe do zbadania u bakterii dzięki wdrożeniu mikroskopii wysokorozdzielczej?

🏅👨‍🔬 Stefan W. Hell, William E. Moerner i Eric Betzig.

Otrzymali oni Nagrodę Nobla z chemii w 2014 roku.

❓🏆 Kto otrzymał Nagrodę Nobla za rozwój mikroskopii wysokorozdzielczej?

🔦🍩 Dwie wiązki lasera.

Pierwsza wzbudza fluorescencję, a druga (wiązka STED) wygasza ją w zewnętrznym pierścieniu (ma kształt obwarzanka/donuta), pozostawiając aktywny tylko bardzo mały obszar centralny.

❓🔴 Na czym polega technika STED (opracowana przez Stefana Hella)?

📉🌑 Wymuszone wygaszanie emisji

(ang. Stimulated Emission Depletion).

❓📖 Co oznacza skrót STED?

✨📍 Lokalizowaniu pojedynczych cząsteczek.

Opiera się na fakcie, że środek pojedynczego, punktowego źródła światła można wyznaczyć z dokładnością znacznie większą niż szerokość plamki dyfrakcyjnej.

❓🎯 Na jakiej zasadzie opiera się druga grupa technik (tzw. mikroskopia pojedynczej cząsteczki), rozwijana przez Betziga i Moernera?

💡🔄 Włączanie i wyłączanie fluorochromów.

W danej chwili świeci tylko nieliczna, rozproszona grupa cząsteczek (nie nakładają się na siebie), co pozwala precyzyjnie namierzyć ich środki. Obraz powstaje z sumowania tysięcy takich cykli.

❓🖼 W jaki sposób uzyskuje się obraz w mikroskopii pojedynczej cząsteczki, skoro plamki światła normalnie by się zlewały?

🌊🔬 Badanie mikroorganizmów wodnych.

Metoda ta odgrywa w tej dziedzinie coraz większą rolę.

❓💧 W badaniu jakiej grupy mikroorganizmów (ze względu na środowisko) cytometria przepływowa odgrywa szczególnie dużą rolę?

❌🔬 Nie.

Jest to technika pomiarowa, która nie tworzy obrazu komórki w taki sposób jak mikroskop, ale pozwala na jej szybką analizę.

❓🤔 Czy cytometria przepływowa jest metodą mikroskopową sensu stricto?

✨🚦 Na podstawie fluorescencji.

Może to być fluorescencja naturalna komórek lub uzyskana dzięki odpowiednim barwnikom.

❓🎨 Na podstawie jakiej właściwości fizycznej komórek następuje ich charakteryzowanie i rozróżnianie w cytometrze?

🧩🔀 Fizyczne posortowanie (rozdzielenie).

Urządzenie potrafi wyłapać komórki o określonych parametrach i oddzielić je od reszty.

❓🤲 Co (poza liczeniem i analizą) umożliwia cytometria przepływowa w odniesieniu do badanych komórek?

🔢📏 Liczbę wszystkich komórek oraz ich wielkość.

Jest to metoda szybka i dokładna.

❓📈 Co można szybko i dokładnie określić, stosując barwnik DAPI w cytometrii przepływowej?

🩺🧟 Stan fizjologiczny komórek.

Pozwala ocenić żywotność bakterii (np. czy mają uszkodzone błony).

❓🧬 Co można zbadać, wykorzystując w cytometrii zestaw LIVE/DEAD BacLight™?

🐟🌳 Przynależność filogenetyczną.

Połączenie cytometrii z tą metodą pozwala zidentyfikować, jakie grupy organizmów znajdują się w badanej próbce.

❓🎯 Co pozwala określić zastosowanie metody FISH w cytometrii przepływowej?

🌊📉 Długość fali promieniowania.

Strumień elektronów ma znacznie krótszą długość fali (związaną z falami de Broglie’a) niż światło widzialne, co pozwala uzyskać lepszą rozdzielczość.

❓🔬 Jaki parametr fizyczny decyduje o tym, że mikroskop elektronowy ma znacznie wyższą zdolność rozdzielczą niż optyczny?

📏🚀 0,1–0,5 nm.

Jest to około 1000 razy lepsza rozdzielczość niż w mikroskopie świetlnym.

❓📏 W jakim przedziale mieści się zazwyczaj zdolność rozdzielcza mikroskopu elektronowego?

👨‍🔬🏅 Ernst Ruska (wraz z Maxem Knollem zbudowali pierwszy mikroskop w 1932 r.).

Ruska otrzymał Nagrodę Nobla w 1986 r.

❓🏆 Kto jest uznawany za twórcę pierwszego mikroskopu elektronowego i został za to uhonorowany Nagrodą Nobla?

🧲🌀 Cewki elektromagnetyczne.

Pełnią one funkcję soczewek, których zdolność skupiania zależy od wartości prądu płynącego w obwodzie.

❓⚙ Co pełni funkcję soczewek w mikroskopie elektronowym (zamiast szkła)?

⚛🛡 Rozpraszanie elektronów.

Zależy ono od liczby atomowej pierwiastków tworzących preparat. Elektrony są silnie rozpraszane na jądrach o dużej zawartości protonów.

❓⚫ Na jakim zjawisku fizycznym opiera się powstawanie kontrastu w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM)?

⚖🧪 Związkami metali ciężkich.

Przykłady: ołów, osm, wolfram, uran. Atomy te silnie rozpraszają elektrony, zatrzymując je na przysłonie, co daje ciemniejszy obraz w miejscach ich nagromadzenia.

❓🎨 Czym należy dodatkowo kontrastować utrwalone preparaty biologiczne w TEM, aby były widoczne?

🔪🍰 Ultratomia (krojenie na ultracienkie skrawki).

Materiał utrwala się, zatapia w żywicy i kroi, aby badać anatomię wnętrza komórek.

❓🔬 Jaką technikę przygotowania preparatu stosuje się w TEM do badania wewnętrznej budowy (anatomii) bakterii?

➖🦠 Barwienie negatywne.

Stosuje się sole kwasu fosforowolframowego, które barwią tło, pozostawiając obiekt (np. wirusa) jasnym.

❓💉 Jaka metoda barwienia w TEM jest używana do obrazowania wirusów lub izolowanych struktur komórkowych bez ich krojenia?

❄🧊 Szybkie mrożenie w ciekłym etanie/propanie.

Zapobiega to tworzeniu kryształów wody i niszczeniu struktur – powstaje amorficzna warstwa lodu (szkliwa).

❓🥶 Na czym polega przygotowanie próbki w mikroskopii krioelektronowej (Cryo-EM)?

🧬🔍 Stan zbliżony do natywnego (naturalnego).

Pozwala to badać strukturę makrocząsteczek (np. wirusów, kompleksów białkowych) z rozdzielczością molekularną, a nawet prawie atomową (~4 Å).

❓✅ Jaka jest główna zaleta Cryo-EM w porównaniu do klasycznego TEM w kontekście stanu badanych cząsteczek?

🏔👀 Powierzchnię preparatu (topografię).

Obrazy charakteryzują się dużą głębią ostrości i sprawiają wrażenie trójwymiarowych (3D).

❓🖼 Co przede wszystkim obrazuje skaningowy mikroskop elektronowy (SEM)?

🪙⚡ Napylenie cienką warstwą złota lub platyny.

Warstwa ta musi być bardzo dobrym przewodnikiem elektryczności, aby odprowadzać ładunek.

❓🛠 Co trzeba zrobić z powierzchnią preparatu przed włożeniem go do SEM (po odwodnieniu)?

📉📐 Różnego nachylenia powierzchni.

Im większy kąt tworzy powierzchnia z wiązką, tym mniej elektronów wtórnych/wstecznych dociera do detektora (fragment jest ciemniejszy).

❓🎨 Z czego wynika kontrast w obrazie SEM?

📏🔢 1–10 nm.

Zakres powiększeń jest szeroki: od 10x do 200 000x.

❓📏 Jaka jest typowa rozdzielczość skaningowego mikroskopu elektronowego?

💊🛡 Stanu osłon komórkowych.

Np. obserwacja zmian kształtu komórek lub uszkodzeń powierzchni pod wpływem antybiotyków.

❓💊 Do badania jakich efektów działania leków na bakterie często wykorzystuje się SEM?