Chapitre 4 : Dissection génétique du circuit fonctionnel

Quelle fraction de la variation génétique contribue réellement aux différences phénotypiques ?

Seul un sous-ensemble de la variation génétique contribue de manière significative aux différences phénotypiques observées.

Quel est l’objectif central de la génomique moderne ?

Identifier les variantes causales et les gènes qu’elles influencent.

Pourquoi cette connaissance est-elle importante ?

Elle soutient :

• le diagnostic clinique,

• le développement de médicaments,

• la médecine personnalisée,

• la sélection génomique et l’édition génomique en agriculture.

Comment agissent typiquement les variantes causales ?

Elles agissent principalement en cis, sur un ou plusieurs gènes voisins, représentant la perturbation moléculaire primaire.

Que sont les effets trans ?

Des conséquences en aval sur des gènes situés ailleurs dans le génome, parfois sur d’autres chromosomes.

Que permettent d’expliquer les effets cis et trans combinés ?

Comment la variation génétique se propage dans les réseaux régulateurs pour façonner le phénotype.

En quoi consiste l’approche génétique forward ?

En utilisant des corrélations entre le génotype (variantes naturellement présentes) et le phénotype (intermédiaire ou final) dans des populations (environnementale ou naturelle).

En quoi consiste l’approche génétique reverse ?

À perturber artificiellement le génome pour observer la réponse phénotypique.

Pourquoi l’approche reverse n’est-elle pas considérée comme naturelle ?

Parce qu’elle repose sur une perturbation expérimentale artificielle du génome.

Comment peuvent être appliquées les perturbations génétiques ?

De façon constitutive ou conditionnelle, dépendante de l’espace et du temps.

Dissection génétique forward : clonage positionnel

Quelle approche a dominé l’identification des gènes mendéliens entre 1985 et 2005 ?

Le clonage positionnel.

Quelles étaient les étapes clés du clonage positionnel ?

• Cartographie avec marqueurs polymorphes (microsatellites dans les familles affectées)

• Cartographie fine par déséquilibre de liaison

• Clonage et séquençage de la région critique

Quelle a été la contribution de cette approche ?

L’identification de mutations responsables d’environ 2 000 maladies monogéniques (jusqu’en 2003).

Comment le NGS a-t-il transformé l’identification des mutations causales ?

Il a rendu le WGS à 30× peu coûteux (< 1 000 € par échantillon), accélérant fortement les découvertes.

Combien d’individus faut-il souvent séquencer pour identifier une mutation causale ?

Un petit nombre d’individus affectés et de parents proches peut suffire.

Quel type de variants est principalement recherché ?

Des variants rares perte de fonction (LoF) partagés chez plusieurs individus affectés.

Combien de gènes causaux sont listés dans OMIM ?

Environ 5 000 gènes.

Pourquoi les familles consanguines sont-elles utiles pour identifier des gènes monogéniques ?

Elles présentent de longues régions d’homozygotie partagée chez les individus affectés.

Quelle stratégie est utilisée dans ces familles ?

Identifier des régions d’homozygotie chevauchantes via SNP ou WGS.

Sur quels individus l’étude est-elle généralement menée ?

Les enfants affectés et leurs deux parents.

Quel exemple clinique est décrit avec le gène MYH3 ?

Des enfants atteints de dystonie linguale avec deux SNP homozygotes dans MYH3.

Quels phénotypes sont associés aux LoF de MYH3 ?

Arthrogrypose, scoliose, confirmés après phénotypage approfondi.

Qu’est-ce que la cartographie de QTL ?

Une méthode pour identifier les régions génomiques contribuant à la variation de traits quantitatifs.

Sur quoi repose la cartographie de QTL ?

Sur les événements de recombinaison observés dans les familles ou croisements expérimentaux.

Que recherche-t-on statistiquement ?

La co-ségrégation entre marqueurs génétiques (microsatellites ou SNPs) et le trait étudié.

Quels sont les deux grands types de tests d’association génétique ?

• Trait continu vs SNP → régression linéaire

• Statut de maladie vs SNP → régression logistique / étude cas-témoins

Comment les résultats GWAS sont-ils généralement visualisés ?

À l’aide de Manhattan plots, qui montrent la significativité de chaque SNP à travers le génome.

Que représente un pic dans un Manhattan plot ?

Un pic GWAS est une région du génome où plusieurs SNPs sont en associaion avec un trait et où certains SNPs sont en déséquilibre de liaison avec la variante causale.

À quoi servent les QQ plots en GWAS ?

À visualiser les effets des tests multiples

Comment la stratification de population apparaît-elle sur un QQ plot ?

Par un décalage systématique de tous les points dans une même direction.

Quelle est la taille typique d’un pic GWAS ?

Environ 250 kb, englobant des milliers de variants et en moyenne ~5 gènes.

Pourquoi l’interprétation des pics GWAS est-elle difficile ?

Parce qu’ils contiennent beaucoup de variants corrélés dans un même pic et nécessitent des cohortes très larges et une densité élevée de variants.

Quand un gène peut-il être directement identifié à partir d’un GWAS ?

Lorsque la variante causale est codante, ce qui est relativement rare.

Où se situent la majorité des variantes causales sous les pics GWAS ?

Dans des régions régulatrices non codantes.

Quel est le mécanisme fonctionnel le plus fréquent de ces variantes ?

La modification du niveau d’expression du gène cible.

Comment appelle-t-on ces effets sur l’expression génique ?

Des expression quantitative trait loci (eQTL).

Quelle est la différence entre eQTL cis et eQTL trans ?

• cis-eQTL : agissent sur des gènes proches, souvent spécifiques d’un tissu

• trans-eQTL : agissent sur des gènes distants, parfois sur d’autres chromosomes (ex. facteur de transcription)

Peut-on cartographier les eQTL à l’échelle du génome ?

Oui, via des balayages pangénomiques d’eQTL.

Pourquoi un chevauchement GWAS–eQTL n’est-il pas une preuve de causalité ?

Parce qu’il faut démontrer que la même variante est responsable du signal GWAS et de l’effet cis-eQTL.

Pourquoi cette démonstration est-elle difficile ?

• Les données d’expression ne sont souvent pas disponibles pour la même cohorte utilisée dans le GWAS.

• Les traits complexes sont fortement polygéniques (effets faibles), ce qui signifie que les variantes causales sont attendues même chez les individus sains.

À quoi sert la base de données GTEx ?

À identifier des eQTL dans des tissus sains associés à des pics GWAS liés aux maladies.

Que contient GTEx ?

Des données d’expression d’environ 50 tissus chez ~1 000 individus.

Quelle est la principale limite actuelle de GTEx ?

Le manque de diversité, de stades développementaux et de tissus supplémentaires.

Quel est l’objectif des tests de charge ?

Identifier des gènes causaux en comparant l’accumulation de variants rares perturbateurs entre cas et témoins.

→ Consiste à séquencer par NGS un gène chez des cas et des témoins et puis comparer la charge en variants rares délétères.

Quelle hypothèse sous-tend les tests de charge ?

Qu’un gène causal contient plus de variants rares délétères chez les cas que chez les témoins.

Un chevauchement GWAS–test de charge est-il suffisant pour conclure ?

Non, c’est suggestif mais pas une preuve formelle de causalité.

Quelle est la relation entre gènes identifiés par GWAS et par tests de charge ?

Ils identifient souvent des gènes différents, avec un chevauchement partiel.

Quelle proportion des gènes soutenus par des tests de charge se situe dans les loci GWAS ?

Environ 26 %, après analyse de 209 traits quantitatifs dans la UK Biobank.

→ la majorité des gènes identifiés par test de charge ne sont pas proches des GWAS.

Quels types de gènes sont favorisés par les tests de charge LoF ?

Les gènes longs et spécifiques d’un trait.

Pourquoi les GWAS peuvent-ils identifier des gènes manqués par les tests de charge LoF ?

Parce que des variants régulateurs dépendants du contexte peuvent agir sur des gènes hautement pléiotropes sans produire d’effet LoF clair.

Que suggère l’absence de signal de charge LoF dans de nombreux loci GWAS ?

Que des variants régulateurs contextuels sont des contributeurs majeurs aux traits complexes.

Que se passe-t-il si un gène est haploinsuffisant ?

Une variante délétère hétérozygote peut provoquer une maladie dominante, parfois sévère ou létale.

Pourquoi ces variants sont-ils rarement capturés par les tests de charge ?

Parce que les individus porteurs sont peu susceptibles d’être recrutés dans des cohortes d’étude standards.

Dissection génétique reverse du circuit causal

Pourquoi la génétique reverse n’est-elle pas possible chez l’homme ?

Elle n’est réalisé que dans des systèmes modèles

Dans quels systèmes la génétique reverse est-elle réalisée ?

• Cultures cellulaires

• Organismes modèles

Avantage principal des lignées cellulaires établies ?

Prolifération indéfinie et facilité de transfection/transduction.

Origine typique des lignées cellulaires établies ?

Elles sont généralement dérivées de tumeurs.

Quelle alternative aux lignées cellulaires établies existe-t-il ?

les cellules primaires provenant du sang, de biospies, etc.

Limites des cellules primaires ?

• Prolifération limitée

• Difficultés de transfection/transduction

• Besoin de milieux de croissance spécialisés

Qu’est-ce que l’ADN exogène ?

ADN introduit artificiellement dans une cellule.

Quelles sont les deux grandes méthodes d’introduction d’ADN exogène ?

• Transfection

• Transduction

En quoi consiste la transfection ?

Introduction d’un plasmide contenant le gène d’intérêt (souvent un cDNA), nécessitant une électroporation ou lipofection.

En quoi consiste la transduction ?

Introduction d’ADN via des vecteurs viraux.

Quels types de vecteurs viraux sont mentionnés ?

• Rétrovirus

• Lentivirus

• Adénovirus

Différence clé entre rétro/lentivirus et adénovirus ?

• Rétrovirus/lentivirus → intégration dans le génome & expression élevée d’ADN

• Adénovirus → ADN reste sous forme d’épisome

Que sont les iPSC ?

Des cellules dédifférenciées à partir de cellules somatiques. Ces cellules peuvent ensuite être injectées dans des blastocytes.

Quels facteurs de transcription sont utilisés pour générer des iPSC ?

• Sox2

• Oct4

• Klf4

• Myc

Que peuvent former les iPSC ?

Des organoïdes 3D

Intérêt principal des iPSC ?

• Compréhension des maladies

• Criblage de nouveaux médicaments

Organismes modèles et transgenèse

Comment peut-on modifier génétiquement des organismes modèles ?

• Introduction de transgènes sous le contrôle d’un promoteur

• Microinjection dans des œufs fécondés

Rendement typique de la microinjection transgénique ?

Environ 1 à 5 % de descendants transgéniques.

Principe de la recombinaison homologue ciblée ?

Insertion d’une séquence d’ADN encadrée par des régions homologues au locus cible.

Fréquence naturelle de la recombinaison homologue ?

Très rare : 1 événement pour 10⁶ à 10⁹ cellules.

→ Nécessite un marqueur sélectable

Quel événement augmente fortement la recombinaison homologue ?

L’introduction de cassures double brin ciblées.

Principe des nucléases à doigts de zinc (ZFN) ?

• Motifs zinc-finger liant l’ADN

• Fusionnés à l’endonucléase FokI

Principe des TALEN ?

• Effecteurs TAL (Activator-like transcription)

• Associés à la nucléase FokI

Que se passe-t-il en absence de réparation par homologie ?

• Réparation par indels

• Entraîne souvent une mutation LoF

Que se passe-t-il quand les nucléases sont fournies avec de l’ADN donneur ?

Elles peuvent remplacer des segments d’ADN spécifiques via la réparation dirigée par homologie.

Quel est l’exemple le plus célèbre de nucléase programmable ?

CRISPR-Cas9

Avantages de CRISPR-Cas9 par rapport aux TALEN ?

• Moins coûteux

• Guides faciles à produire

• Ciblage de nombreuses positions génomiques

Limite importante de Cas9 ?

Présence d’effets hors cible.

Qu’est-ce que le dead Cas9 ?

Une Cas9 qui se lie à l’ADN sans le couper.

Utilité du dead Cas9 ?

• Enrichissement ciblé

• Études fonctionnelles sans coupure

Intérêt potentiel du système CRISPR-Cas ?

Nouvelle approche pour la découverte de médicaments.

Comment étudiait-on classiquement la fonction d’un nouveau gène ?

En réalisant un knock-out (KO) du gène pour observer les conséquences phénotypiques.

Quelle méthode de knock-down est utilisée chez le poisson-zèbre ?

L’injection d’ARN antisens morpholinos directement dans les embryons.

Quels types de knock-out existent chez la souris ?

Des KO constitutifs (actifs dans toutes les cellules) ou conditionnels (restreints à un tissu ou un moment donné).

Qu’est-ce que la méthode TILLING ?

Une approche de mutagénèse ciblée utilisant le mutagène chimique ethyl méthanesulfate (EMS) pour induire des mutations ponctuelles dans le génome.

Quel type de mutations induit l’EMS ?

Des transitions G:C → A:T.

Quel est l’effet de l’EMS sur le taux de mutations ?

Il augmente le taux de mutations de novo d’environ 100 fois.

Pourquoi une bibliothèque de ~10 000 poissons mutagénisés est-elle utile ?

Elle permet d’assurer que presque chaque cadre de lecture contient au moins une mutation.

À quels types de cellules la méthode TILLING peut-elle aussi s’appliquer ?

Aux cellules souches embryonnaires.

Comment débute un pipeline TILLING chez le poisson-zèbre ?

Par le traitement de mâles avec l’EMS, puis leur croisement avec des femelles sauvages.

Que porte chaque individu F1 issu de ce croisement ?

Une collection unique de mutations ponctuelles hétérozygotes.

Pourquoi le sperme des mâles F1 est-il cryopréservé ?

Pour pouvoir récupérer ultérieurement une lignée portant une mutation d’intérêt.

Comment les mutations sont-elles détectées ?

• L’ADN du sperme est extrait et poolé dans un format de 96 puits pour le criblage des mutations.

• La PCR et le séquençage à haut débit sont ensuite utilisés pour détecter les mutations dans le gène d’intérêt.

Que se passe-t-il après l’identification d’une mutation d’intérêt ?

Le sperme correspondant est décongelé pour générer une lignée F2 portant la mutation.