Metody chromatografi i spektrometri mas

Jaki to pik?

Gaussowski

Jaki to pik?

ogonujący

Jaki to pik?

rozmyty w części przedniej

Definicja chromatografi

Fizykochemiczna metoda rozdzielania mieszanin jednorodnych w wyniku ich różnego podziału między fazę ruchomą i stacjonarną układu chromatograficznego (technika analityczna i preparatywna)

Klasyfikacja metod chromatograficznych (ze względu na stan skupienia fazy ruchomej)

• gazowa GC

• cieczowa LC

• w fazie nadkrytycznej SFC

Eluent

Fazą ruchomą przed zmieszaniem z próbką

Elucja

Proces w którym substancje rozpuszczone przemieszczają się przez fazę fazę stacjonarną.

Eluat

Fazą ruchomą, która opuszcza kolumnę (składnik próbki + eluent)

Retencja

Zjawisko wolniejszej migracji składników rozdzielanej mieszaniny niż prędkość przepływu eluentu

Kiedy układ chromatograficzny jest selektywny?

Kiedy każdy składnik mieszaniny wprowadzanej wykazuje zróżnicowaną retencję

Jak opisana jest selektywność (matematycznie)

[$\alpha$] współczynnik rozdzielenia

Stosunek współczynników retencji sąsiednich stref rozdzielanych substancji

Całkowity czas retencji

[tR] Czas przebywania składnika w układzie od momentu zdozowania do zarejestrowania piku.

Czas retencji substancji niezatrzymywanej

[tm] czas przejścia przez układ chromatograficzny substancji która nie oddziałuje ze złożem

Zredukowany czas retencji

[t'R] czas w którym związek oddziałuje ze złożem chromatograficznym

Współczynnik retencji

[k] stosunek t'R/tM

Izoterma sorpcji

Stosunek między ilością substancji zaabsorbowanej, a stężeniem w fazie ruchomej przy stałej temperaturze

Kiedy przebieg izotermy jest liniowy?

Kiedy stosunek między stężeniem substancji w fazie ruchomej, a zaabsorbowanej w fazie ruchomej jest liniowy

Współczynnik podziału

[K] określą nachylenie krzywej izotermy sorpcji Cs/Cm

Im większa rozdzielczość…

Tym piki mniej nakładają się na siebie

Analiza ilościowa (zależność)

Powierzchnia i intensywność piku jest proporcjonalna do całkowitej ilości związku. Przyrost tej powierzchni jest proporcjonalny do przyrostu ilości tego związku.

Rozklad temperatury w chromatografi

• Stała

• Programowana

Elementy CG

• Regulator przepływu

• Dozownik

• Termostat

• Kolumna

• Detektor

Gazy nośne w chromatografii gazowej

• Wodór

• Azot

• Argon

• Hel

Cechy dobrego gazu nośnego

• Niska lepkość

• Mała gęstość

• Duży współczynnik dyfuzji

• Przystępna cena

• Dostępność

• Czystość >99.999%

• Kompatybilny z typem detektora

Jakie substancje można analizować w GC

• Temperatura wrzenia/sublimacji nie przekracza 350 - 400°C

• W warunkach chromatografowania mają postać par i gazów (20% związków chemicznych)

Na czym polega split injection

Cześć próbki trafia do kolumny i podlega analizie, a część jest usuwana na zewnątrz i tracona.

Czemu przeprowadza się split injection?

• Redukcja rozmycia piku związanego z gwałtownym parowaniem próbki w dozowniku

• Lepsza rozdzielczość

Sposoby przygotowania próbek lotnych

• Headspace

• Mikroekstrakcja do fazy stałej

• Dwrywatyzacja

Derywatyzacja próbek lotnych (co chcemy osiągnąć?)

• Zmniejszenie polarności

• Zwiększenie stabilności termicznej

• Wzrost lotności

Rodzaje kolumn

• Pakowane (z wypełnieniem)

• Kapilarne (o otwartym przekroju) - WCOT, PLOT, SCOT

Kolumna Kapilarna WCOT

Wall-coated open tubular - są pokryte nielotną fazą stacjonarną w stanie ciekłym

Kolumna kapilarna PLOT

Porous-Layer Open Tubular - ścianki pokryte są warstwą ziaren adsorbentu

Kolumny kapilarne SCOT

Support-coated open tubular - ścianki pokryte ziarnami adsorbentu, a przestrzenie między nimi fazą stacjonarną ciekłą

Z czego stworzone są kolumny + czemu ten materiał jest lepszy niż szkło

Stopiony kwarc (ditlenek krzemu) jest on bardziej elastyczny i wytrzymały co ułatwia jego formowanie

Typy detektorów (selektywność)

• Uniwersalne - odpowiadają sygnałem na każdą substancję eluującą

• Selektywne - reagują na specyficzne struktury i grupy funkcyjne

FID działanie i nazwa, selektywność

Detektor płomieniowo jonizacyjny - składniki próbki ulegają spaleniu, 0.001% atomów C ulega jonizacji sygnał z detektora jest proporcjonalny do liczby atomów węgla nie związanych z tlenem

Nie wykrywa zw. Nieorganicznych, CO, CO2, CS2, HCOOH, COCl2

ECD - działanie i nazwa, selektywność

Detektor wychwytu jonów - izotop promieniotwórczy Ni$^{63}$ dostarcza elektronów.

Elektroujemne związki wychwytują elektrony i zmniejszają prąd.

Selektywność: chlorowce, azotany, skoniugowane grupy karbonylowe (2x C=O obok siebie)

LC do jakich związków?

• Farmaceutyki

• Agrochemikalia

• Białka

• Jony organiczne

• Jony nieorganiczne

• Biopolimery

Po co umieszczamy prekolumny?

Zapobiegają zanieczyszczeniom kolumny wychwytując substancje nieodwracalnie wiążące się z kolumną oraz cząstki zapychające ją. Są tańsze i wymienne. Przedłużają żywotność kolumny.

Wypełnienie kolumny + modyfikacje

Normalny układ faz: żel krzemionkowy (polarny)

HILIC: żel krzemionkowy + grupy amonowe NH2 i cyjanowe NC (polarny)

Odwrócony układ faz: żel krzemionkowy + łańcuchy alkilowe 8C i 18C, najlepsze alkilochlorosilany (niepolarne)

Jaki jest czas elucji i retencji związków niepolarnych w RP LC

Wolniejszy

Fazą ruchoma w HILIC - skład, polarność, siła elucyjna

Przeważnie 60% dodatku organicznego do wody lub buforu - im więcej wody tym bardziej polarne i tym większa siła elucyjna w stosunku do związków polarnych.

Elementy LC

• Port iniekcyjny/dozownik

• Pompa

• Detektor

• Kolumna

• Termostat

• Zbiornik fazy ruchomej

Typy detektorów UV

I pracujące przy fali $\lambda$=254nm (65% substancji organicznych)

II UV + Vis (190 - 600 nm) z możliwością regulacji fali

III DAD Diode array detector z linijką diodową

Jakie związki dobre do wykrycia przez detektory UV

• Barwniki

• Olefiny

• Związki aromatyczne

• Związki z wiązaniami nienasyconymi

Czego nie wykrywają detektory uv

Cukry

Jaki detektor do analizy cukrów

RID - detektor refraktometryczny

Na czym polega chromatografia płynem nadkrytycznym i do czego jest przydatna?

Płyn nadkrytyczny w fazie ruchomej powoduje wysokie ciśnienie, co pozwala na wykrycie niskich stężeń molekuł o dużej masie cząsteczkowej

Co to płyn nadkrytycznym

Stan substancji oscylujący między gazowym, a ciekłym.

Substancja o właściwościach rozpuszczalnika, gęstości zbliżonej do cieczy jednak o wiekszej dyfuzyjności niż ciecz.

Jakie rozpuszczalnika nadkrytyczne się stosuje

• CO2 najczęściej

• Etan

• Etylen

• Propan

• Propylen

• Trichlorometan

• Cykloheksan

• Toluen

• Woda

Chromatografia cienkowarstwowa na czym polega

Fazą stała w postaci cienkiej warstwy rozprowadzona jest na płytce.

LC x LC co to

Jest to dwuwymiarową chromatografia cieczowa, którą analizuje się bardziej skomplikowane mieszaniny

Typy LC x LC

• Off-line (frakcje z pierwszej kolumny są zbierane i dozowane na drugiej kolumnie)

• Z zatrzymywaniem przepływu strumienia fazy ruchomej (chwilowe zatrzymanie przepływu frakcji z pierwszej kolumny do momentu całkowitej elucji analitów z drugiej kolumny)

• On-line (system łączony, rozdzielenie następuje w czasie rzeczywistym)

Zastosowanie SM (10)

• Identyfikacja i oznaczanie ilości poszczególnych składników mieszanin

• Badanie kinetyki i termodynamiki reakcji chemicznych

• Ustalanie składu izotopowego substancji i tym samym określenie ich pochodzenia

• Identyfikacja struktury cząstek

• Badanie sekwencji białek i polisacharydów

• Identyfikacja substancji w kosmosie

• Monitoring zanieczyszczeń środowiska

• Wykrywanie fałszerstw i skażeń żywności

• Badania antydopingowe

• Monitorowanie procesów przemysłowych

Jonizacja

Zjawisko powstawania jonu - kationu lub anionu z obojętnego atomu lub cząsteczki

Typy jonów

• Jon molekularny

• Pseudomolekularny

• Fragmentacyjny

Jon molekularny

• Masa cząsteczkowa równa badanego związku

• Przyłączenie lub oderwanie elektronu

Jon pseudomolekularny

• Przyłączenie Na+, H+, Cl- lub

• Oderwanie H+

• Proponowana/deprotonowana

Jon fragmentacyjny

• w wyniku spontanicznej fragmentacji (EI, SM tandemowa)

• Specyficzne dla substancji analizowanej

• Dostarcza informacji o strukturze

Elementy SM

• Inlet

• Źródło jonów

• Analizator

• Pompy próżniowe

• Detektor

Typy analizatorów SM + dokładność

• TOF Time of flight, analizator czasu przelotu (4-5 miejsc po przecinku)!!! Najdokładniejsze

• Quadrupole (1 miejsce po przecinku)

• Ion trap, pułapka jonowa (2-3 miejsca po przecinku)

Typy źródeł jonów w SM

• EI Electron Ionisation

• ESI Electrospray Ionosation

• APCI Atmospheric pressure chemical ionisation

• MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation

• Desorption electrospray Ionisation DESI

EI - nazwa i produkty

Jonizacja strumieniem elektronów,

Kationorodniki, anionorodniki

ESI - nazwa + co jonizujemy

Jonizacja napięciem elektrycznym połączona z rozpylaniem

JONOWE + POLARNE

jonizacja H20 / metanol

Z transferem ładunku i jonizacją analitów i adduktów metali zasadowych, amonowych, kwasów organicznych:

• [M+H]+

• [M+H]-

• [M+Na]+

• [M+K]+

• [M+NH4]+

• [M+HCOO]-

• [M+CH3COO]-

CJ - nazwa, jakie jony dostarcza

Chemical Ionisation

Jonizacja strumieniem elektronów gazu (metan) dostarcza jony pierwotne i wtórne

APCI - jakie gazy jonizujemy + jakie substancje podlegają

N2 O2

Substancje sredniopolarne i hydrofobowe

MALDI - produkty

• [M+H]+

• [M+H]-

• Jony fragmentacyjne

Masa atomowa

Pokazuje ile razy masa danego atomu jest większa od 1/12 masy izotopu węgla 12C (unit [u]/ dalton [Da])

Masa izotopowa

Inna liczba neutronów dwóch atomów tego samego pierwiastka = inna liczba masowa

Jak powstaje widmo masowe

Pod wpływem działania strumienia elektronów o odpowiedniej energii związki organiczne ulegają rozpadom. W zależności od szybkości tworzenia jonu i szybkości jego daleszego rozpadu powstaje dana intensywność piku.

Reguła azotu

Można spodziewać się obecności azotu w przypadku nieparzystej masy cząsteczkowej

Reguła chloru

Pik izotopowy wykazuje intensywność 32% w stosunku piku jonu M+

Reguła bromu

Piku izotopowy wykazuje intensywność 1:1 względem piku M+

Węglowodory nasycone w widmie masowym

Grupy pików oddalone są od siebie o 14 jednostek masy

Węglowodory aromatyczne (alkilowe pochodne benzenu)

Jon tropyliowy m/z = 91

Parametry walidacji (8)

• Powtarzalność

• Dokładność

• Prawdziwość

• Precyzja

• Liniowość

• S/N (stosunek sygnału do szumu)

• LOD

• LOQ

Powtarzalność

Wartość precyzji pomiaru dla grupy wyników uzyskanych w tych samych warunkach

Dokładność

Zgodność wyniku pomiaru z wartością oczekiwaną/rzeczywistą

Prawdziwość

Zgodność wyniku oznaczenia obliczonego na podstawie serii pomiarów z wartością oczekiwaną/rzeczywistą

Precyzja

Zgodność między niezależnymi wynikami, a zastosowaniem danej procedury analitycznej

Liniowość

Sygnał wyjściowy jest proporcjonalny do oznaczanego stężenia analitu

S/N

Stosunek sygnału do szumu (wysokość piku/szerokość piku)

LOD

Limit of detection - najmniejsza ilość/stężenie substancji możliwe do wykrycia S/N=3 do 5

LOQ

Limit of Quantitation - najmniejsza ilość/stężenie substancji możliwa do ilościowego oznaczenia w danej metodzie z założoną dokładnością i precyzją

LOQ = 2x/3x/6x LOD

Informacje z baz danych

• Struktura chemiczna

• Właściwości fizykochemiczne

• Profile widmowe

• Funkcje biologiczne

• Mapowanie szlaków metabolicznych

Walidacja

Złożony proces, w którym sprawdza się kolejno wszystkie elementy procedury analitycznej pod kątem parametrów walidacji.

Metabolomika

Koncentruje się na produktach o małej masie cząsteczkowej (<1kDa) które są obecne w pojedynczych komórkach, tkankach lub całych organizmach i są przydatne do opisu interakcji między różnymi aspektami fizjologicznymi i procesami farmakokinetycznymi organizmu.

Proteomika

Gałąź nauki dotycząca białek - badaniem ich struktury, sprawowanych funkcji i zależności między nimi.

Ograniczenia baz danych widm masowych

• Niewielka liczba metabolitów dostępnych na rynku w postaci czystych wzorców

• Duża liczba metabolitów o nieznanej strukturze chemicznej

Próbki biologiczne - przez jaki okres utrzymują się substancje

Krew - dane aktualne o stanie organizmu dokładnie w momencie pobrania próbki