24.1: Overzicht van de celcyclus

Welke fasen in de celcyclus

M-fase + interfase

Interfase = G1 + S + G2

G0 = stoppen tijdelijk met delen (bv terminale differentiatie of wachten tot groei-stimulus)

M-fase = mitose en cytokinese

Wat is de generatietijd (tijd om de celcyclus te kunnen doorlopen) voor sneldelende cellen in cultuur (meestal kankercellen, maar kan ook bv embryonale cellen)

18-24h voor sneldelende cellen

wat is mitotische index en hoe bereken je dat

Het is het percentage cellen in mitose vergeleken met het totaal aantal cellen

Mit index = (aantal cellen in mitose) / (totaal aantal cellen)

hoe lang duurt de M-fase in snel delende cellen

30-45 min.

hoe lang duurt S-fase

6-8h

hoe kun je lengte S-fase meten

gebruik 3H-deoxythymidine (radioactief label)

duur G1-fase en wat gebeurt er in deze fase

variabele duur

metabolisch actief

celgroei

eiwit en RNA synthese

(moet allemaal gebeuren want cel is net gedeeld)

wat gebeurt er in G2 fase

voorbereiden op mitose

slide chromosomen

Wat is flow cytometrie en hoe doe je dat

Flow cytometrie laat meting toe van optische (celvorm en -grootte) en fluorescentiekarakteristieken van individuele cellen in suspensie.

• Mengsel met verschillende celtypes → homogene suspensie van maken (mengsel van identieke en verschillende cellen). Het mengsel wordt behandeld met fluorescente antilichamen of DNA kleurstof.

• De cellen worden door een opening geduwd zodanig gekozen dat er maar 1 cel tegelijk door kan gaan.

• Een laser zendt monochromatisch licht uit (= licht van 1 bepaalde golflengte) en de fluorescente lichtintensiteit wordt gemeten.

• Er ontstaat lichtverstrooiing → deze verschilt tussen de celtypes omdat de lichtstrooiing gerelateerd is aan de celvorm en -grootte (= optische karakteristieken van de cel).

• Ook de fluorescentie wordt gemeten (de cellen zijn na isoleren uit weefsel behandeld met bv een DNA stain (kleurstof dat DNA bindt).

• obv beiden karakteristieken die gemeten werden kan men identificeren hoeveel van elke soort cellen aanwezig zijn.

Toepassingen van flow cytometrie

• Meting van aantal witte bloedcellen (gekenmerkt door een bepaalde oppervlaktereceptor) (= leukocyten), bv macrofagen, lymphocyten

• Meting van de fase van de celcyclus: meting van hoeveelheid DNA

• Flow cytometrie met 2 kleuren: hoeveelheid DNA + merker van M-fase (antilichaam dat een mitotische modificatie van histonen herkent).

wat kun je zeggen over de verhouding van hoeveelheid DNA in G1 fase en G2 fase

Hoeveelheid DNA in G1 (voor replicatie) is de helft minder dan in fase G2 (na replicatie)

wat zie je op deze foto

Je kunt een DNA specifieke kleurstof toevoegen en dan de intensiteit meten met flow cytometrie → hoe meer intensiteit, hoe meer cellen die die intensiteit hebben.

We zien een piek bij ongeveer 70 → dit zijn de cellen die in de G0/G1 fase zitten (ze hebben dezelfde hoeveelheid DNA)

Het plateau in het midden zijn cellen in de S-fase: sommige zijn net gestart met de replicatie, andere zijn bijna klaar…

De kleine piek rechts zijn cellen in de G2/M fase (hebben ook evenveel DNA)

wat zie je op deze foto

Als je wilt bepalen hoeveel cellen in de M-fase aanwezig zijn, kun je flow cytometrie met twee kleuren gebruiken en moet je enkel die in de M-fase markeren (want die in de G2 fase hebben dezelfde hoeveelheid DNA)

Waarvoor staat FACS en hoe werkt het

Fluorescense-activated cell sorting

Flow cytometrie + selectie/sortering vzn cellen obv elektrische lading.

Het geselecteerd celtype kan vervolgens apart worden geanalyseerd.

• Cel mengsel maken → opening zodanig dat je een druppel krijgt waar 1 cel in zit → je gebruikt een laser en lichtverstrooiing → detectie fluorescentie

• Een elektrische lading wordt toegevoegd obv de eigenschappen van de cel

• De druppels bewegen tussen twee elektrisch geladen platen door en worden zo gescheiden obv een elektrisch veld. (Hun lading)

• We verkrijgen 2 buizen met elk een celpopuatie erin. Cellen in eenzelfde buis hebben dezelfde karakteritieken en reflecteren waarschijnlijk een bepaald celtype.

Welke DNA sequenties zijn meest gelijkend op elkaar?

Een paar van zusterchromatiden OF

Een paar van homologe chromosomen?

Zusterchromatiden zijn duplicaten aangemaakt via DNA replicatie(enige verschil zijn de replicatie fouten) terwijl homologe chromosomen verschillende allelen bevatten van een gen (zie hfd 25).

Dus zusterchromatiden zijn meest gelijkend op elkaar