Gene inactivation

Insertional mutagenesis

Gene silencing

Gene editing

Drie hoofdstrategieën om plantgenen te inactiveren

screen many lines for a phenotype of interest, afterwards determine which gene was mutated.

forward genetics

retrieve a line in which your gene of interest is mutated and determine phenotype

reverse genetics

T-DNA from Agrobacterium inserts (rather) randomly in genome

When within a gene, this likely disrupts it

principe T-DNA tagging

T-DNA

Transposon

TILLING

drie manieren voor insertional mutagenesis

co-suppression

RNAi

artificial microRNAs

methodes van gene silencing

Collections of mapped T-DNA insertions

Hundreds of thousands plants with a T-DNA locus, for which flanking regions have been determined

resultaat T-DNA tagging

PCR-based methods are used to identify flanking regions

Doel TAIL-PCR

Thermal asymmetric interlaced PCR

afkorting TAIL-PCR

LB-primers
specifieke, geneste primers die binden in de gekende T-DNA-sequentie

Arbitrary degenerate primers
minder specifieke primers die op verschillende plaatsen in het onbekende flankerende genomische DNA kunnen binden

De LB-primers hebben een hogere Tm; de degenerate primers een lagere Tm

twee soorten primers voor TAIL-PCR

Nested primers: e.g. LB1, LB2 and LB3, primers that lie progressively deeper inside the T-DNA, each nested within the previous one, increasing specificity with each PCR round.

nested primers in context van TAIL-PCR

Round 1: LB1 binds strong, more amplification of the places where LB1 is located

2nd round: PCR product of first round as template, and LB2 used, bit deeper into the T-DNA

(optional 3th round)

De verschillende PCR rondes bij TAIL-PCR

Transposons (jumping genes) are mobile DNA elements

transposons

Source of mutations in plants and humans, but rare: when ending up in GOI

transposons als mutatiebron

when a transposon ‘jumps’ into a gene, you see which effect this gene has. you can determine where this gene is located, by located the known transposon with PCR

principe transposon-tagging

If transposition occurs in the germline, you get a stable insertion of the transposon

when do you have stable insertion of a transposon?

gusA has only a weak minimal promoter. Only when the T-DNA inserts close to an enhancer can that enhancer activate this promoter.

Those enhancers are tissue-specific, so the GUS expression pattern reveals where a tissue-specific enhancer is located.

principe enhancer trap

EMS (ethyl methanesolufonate)

chemical mutagen used for TILLING

EMS adds an ethyl group to guanine base (G) in DNA, forming O-6-ethylguanine.

working EMS

O-6-ethylguanine “mispairs” with thymine (T) during replication instead of cytosine.

This mispairing leads to G:C → A:T transition mutations after DNA replication

gevolg vorming O-6-ethylguanine bij TILLING

Typically EMS mutagenesis introduces about 1 SNP per 7 Mb (can vary by species and conditions).

aantal SNPs door EMS mutagenesis

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes

afkorting TILLING

Er is geen transformatie nodig, waardoor TILLING bij veel plantensoorten toepasbaar is

De verkregen mutanten worden doorgaans niet als GMO beschouwd

TILLING kan zwakke allelen opleveren
dus geen volledige knock-out, maar een gedeeltelijk veranderde eiwitfunctie

Principe:
TILLING is breed toepasbaar en laat toe om naast knock-outs ook subtielere functieveranderingen te vinden.

voordelen TILLING

High background mutation load (barley: 10.000 mutations estimated when 1/500 kb)

Backcrossing needed to eliminate the background mutations

nadelen TILLING

Dubbelstrengig RNA (dsRNA) wordt door Dicer geknipt tot siRNA’s van ongeveer 21–24 nucleotiden

De siRNA’s worden opgenomen in het RISC-complex met een Argonaute-eiwit

RISC gebruikt het siRNA om complementair mRNA te herkennen en af te breken

De transcriptie verloopt dus normaal, maar het mRNA wordt gedegradeerd

Principe:
Bij PTGS wordt genexpressie geremd ná transcriptie doordat specifiek mRNA wordt afgebroken.

werking post-transcriptional gene silencing (PTGS)

Een deel van het doelgen wordt in sense- en antisense-richting in één construct geplaatst

Na transcriptie plooit het RNA tot hairpin-dsRNA

Dicer knipt dit dsRNA in siRNA’s

Deze siRNA’s leiden het RISC-complex naar complementair mRNA, dat vervolgens wordt afgebroken

Principe:
RNAi verlaagt genexpressie door gericht mRNA van een homologe sequentie af te breken

Hoe werkt RNA interference (RNAi)?

1. Transgene expressie in de plant
de plant produceert zelf dsRNA tegen een gekozen doelgen

2. Externe toediening van dsRNA
dsRNA wordt rechtstreeks op de plant gesproeid

Het doel kan een plantgen zijn, maar ook een essentieel gen van een insect of pathogeen

Principe:
RNAi kan dus intern of extern worden aangeleverd en zowel plantgenen als genen van belagers uitschakelen.

Hoe kan RNAi in planten worden toegepast?

DNA methylation of promoter:

Cytosine > methylcytosine

No more transcription

DNA methyltransferase

DNA methylation is heritable (epigenetics)

Transcriptional gene silencing (TGS)

Spontaneous silencing of transgenes during a generation

transgene silencing

when an inserted transgene silences both itself and the homologous endogenous gene (same sequence), not necessarily genes around it

co-suppression

co-suppression

first observed method to silence endogenous genes via sequence homology

Een ingebracht transgen met hoge sequentie-overeenkomst met een endogeen gen kan dsRNA/siRNA-vorming uitlokken

De siRNA’s veroorzaken PTGS
zowel het transgene als het homologe endogene mRNA wordt afgebroken

Dezelfde siRNA’s kunnen ook via RNA-directed DNA methylation DNA-methylatie sturen, waardoor TGS ontstaat

Principe:
Bij co-suppression worden zowel het transgen als het overeenkomstige endogene gen gesilenced door sequentiehomologie.

mechanisme co-suppression

Met een hoog transgene copy number

Met inverted repeats van het transgen

Deze structuren kunnen RNAi en epigenetische silencing activeren

Principe:
Daarom selecteert men bij voorkeur high-quality events met één intacte transgenkopie.

met wat wordt transgene silencing vaak gelinkt?

Need to select high-quality events with a single-copy transgene for stable expression

Selection methods: Southern blot, dPCR, …

Hoe kan je transgene silencing voorkomen?

microRNAs: Small, non-coding RNA molecules of about 21 nucleotides that play a role in the regulation of gene expression

miRNAs

Binds to complementary sequences on messenger RNA (mRNA) and inhibit protein production by:

degrading the mRNA

blocking translation.

mechanisme miRNA

artificial microRNAs

amiRNA

Een bestaande miRNA, bijvoorbeeld miRNA172a uit Arabidopsis, wordt gebruikt als backbone

De seed region wordt aangepast zodat ze complementair is aan het gewenste target-mRNA

Daardoor ontstaat een amiRNA dat specifiek dat mRNA herkent en silenced

De amiRNA kan onder controle van een gekozen promoter worden geplaatst, zodat silencing constitutief of weefselspecifiek gebeurt

Principe:
Bij amiRNA behoud je de natuurlijke miRNA-structuur, maar verander je de targetsequentie om een gekozen gen gericht te silenzen

voorbeeldmechanisme amiRNA

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

afkorting CRISPR

CRIPSR associated genes

afkorting Cas

Een CRISPR-locus bevat:

• cas-genen, die coderen voor CRISPR-geassocieerde eiwitten zoals nucleasen

• een CRISPR-array met afwisselend repeats en spacers

De repeats zijn identieke DNA-sequenties

De spacers zijn verschillende sequenties die afkomstig zijn van eerder binnengedrongen viraal DNA en zo een genetisch geheugen van infecties vormen

Principe:
De cas-genen leveren de afweermachinerie, terwijl de spacers bepalen welk viraal DNA later herkend wordt.

Samenstelling CRISPR locus

160 kDa – 1368 aa

grootte Cas9 protein

dead Cas9: (mutations in both HNH and RuvC domains) can bind DNA but not cut it; used for gene repression (blocking transcription)

dCas9

nickase Cas9 (mutation in one nuclease domain) cuts only one DNA strand (nickase)

nCas9

crRNA bevat de variabele sequentie die complementair is aan het target-DNA en bepaalt dus de specificiteit

tracrRNA heeft een grotendeels constante sequentie en vormt de structuur die nodig is voor binding en activatie van Cas9

In bacteriën vormen crRNA + tracrRNA samen het gidscomplex voor Cas9

In het labo worden beide samengevoegd tot één single guide RNA (sgRNA)

tracrRNA en crRNA in bacteria en in het labo (in context van CRIPSR)

Protospacer adjacent motif

afkorting PAM

In target sequence, not in sgRNA

waar vind je de PAM sequence?

Streptococcus pyogenes: “NGG”

meeste gebruikte species Cas9, met de PAM sequence

Cas9 recognizes the PAM (not the sgRNA)

dsDNA unwinding: local opening of the double DNA helix after PAM recognition, allowing sgRNA to access one strand

sgRNA base pairs with the target DNA sequence (starting from the seed region)

Only with sufficient complementarity does Cas9 become fully active and induce a double-strand break

‘samenwerking’ Cas9 en sgRNA

Also works in eukaryotic cells to make DSB in genome

Wat is een belangrijke constatatie voor CRISPR/Cas9 als gene editing tool?

After splicing, exon–exon junctions are marked by EJCs, indicating where introns were removed

During normal translation, ribosomes remove these EJCs; the stop codon is typically located after the last EJC

If the stop codon is premature, the ribosome stops early and downstream EJCs remain → this is recognized and activates NMD

principe NMD

Nonsense-mediated decay

NMD

An abnormally long 3’ UTR can also trigger NMD

andere factor dat NMD kan triggeren, buiten premature stop codon

One protein: Cas9

Express multiple sgRNAs → these will form multiple RNP complexes that can target multiple loci simultaneously

voordeel van multiplexing bij CRIPSR/Cas9

Transcription Activator-Like Effector Nuclease.

TALEN

Gene editing method, discovered in plants

waarom is TALEN interessant?

Backbone (bacterial part): ori’s, KanR (for selection in E. coli)

T-DNA (plant part):

LB, RB

Selection marker

p35S::Cas9

pU6::sgRNA (you can multiplex this part)

opbouw Cas9 vector voor planten

NLS: directs Cas9 to the nucleus where the DNA is located

belang NLS voor expressie Cas9

addition of introns improves gene expression and mRNA processing in plants (since Cas9 is of bacterial origin)

intronization van Cas9

sgRNA is expressed using a polymerase III promoter (instead of Pol II), because it is a small RNA that requires precise transcription start and end
Pol III naturally transcribes small RNAs such as U6 and U3, which are therefore used as promoters for sgRNA expression

promotor voor expressie van sgRNA

A polyT sequence acts as a termination signal for Pol III, ensuring correct transcript length

stopsignaal voor expressie sgRNA

verschillende stappen voor CRISPR / Cas9 in de praktijk

Know your gene!

belangrijke eerste stap voor je aan gene editing gaat doen

Do you expect strong defects in development or even lethality? (maybe knock down better?)

Are you targeting one or more genes?

Is there gene linkage between the genes you want to knock out? Difficult to separate them via crosses?

vragen die je jezelf moet stellen als je een gen kiest voor knock out

determining the genotypes in each plant after gene editing

genotyping

Backup if one sgRNA fails

Larger deletion is easier to identify with PCR

waarom vaak twee sgRNAs per gene?

Region of the gene is important: targeting early exons (e.g. first exon) increases chance of frameshift and premature stop → stronger knock-out; targeting later regions may still allow partial protein function

waarom is de region of the GOI belangrijk voor het gRNA design?

Off-targets: similar sequences elsewhere in the genome can also be recognized and cut
→ therefore the 20 bp spacer sequence must be highly specific to minimize off-target effects

Wat zijn off-targets en hoe ga je ermee om?

Off-targets zijn vaak voorspelbaar, waardoor je planten met weinig of geen ongewenste mutaties kunt selecteren

Ze komen relatief zelden voor in vergelijking met spontane mutaties

Door meerdere generaties te (terug)kruisen kunnen ongewenste off-targetmutaties worden weggewerkt

Principe:
In plantenveredeling kan je off-targets opsporen, selecteren en via kruising uit de lijn

waarom zijn off targets niet echt een probleem bij plant breeding?

De 20 bp spacer wordt als twee complementaire oligonucleotiden ontworpen

Een Type IIS-restrictie-enzym, zoals BsaI, knipt buiten zijn herkenningsplaats en maakt specifieke sticky ends

De oligonucleotiden krijgen passende overhangs, worden geanneald en directioneel in het geopende vectorconstruct ingebracht

Daarna worden vector en insert verbonden met T4 DNA-ligase

Principe:
Alleen de spacer wordt vervangen; de rest van het CRISPR/Cas9-construct blijft hetzelfde.

cloning van target sequence voor sgRNA in CRISPR/Cas9 construct

Bringing a specific gene or trait from one genetic line into another by repeatedly backcrossing to the recipient (elite) line

introgression

Meiosis is the process of cell division that results in gametes (sperm or egg cells)

meiosis

During meiosis, crossing over takes place between two homologous chromosomes: meiotic recombination

meiotic recombination

At least 1 crossover per chromosome pair (obligate crossover)

obligate crossover

1 percent recombination = 1 centimorgan = 1 cM.

Recombination frequencies between loci are proportional to the distance between them.

> 50 cM: the markers are not paired and behave as if on other chromosomes

genetic distance

Recombination mainly at ends of chromosomes

Less so near centromeres

waar zie je vooral recombination?

A desired gene is introduced together with linked, unwanted genomic regions due to limited recombination

linkage drag

Marker-assisted backcrossing: following all chromosomes!

Conventionally you are blind to this: you can only follow traits

marker-assisted vs conventionally backcrossing