L12: Toxicity of PAHs and particles

Wat zijn PAK’s

1. Natuurlijke producten (Natural products)

• Fossil fuels (Fossiele brandstoffen): PAK's komen van nature voor in ruwe olie, steenkool en bruinkool. Ze zijn miljoenen jaren geleden diep in de aarde gevormd uit organische resten (zoals planten en algen) onder hoge druk en temperatuur. Omdat ze in de brandstof zelf zitten, komen ze vrij bij de verwerking of lekkage ervan.

---

2. Restproduct van onvolledige verbranding (Rest product of incomplete combustion)

Dit is veruit de belangrijkste bron van blootstelling voor de mens en het milieu. Wanneer organisch materiaal (alles waar koolstof in zit, zoals hout, vlees, tabak of olie) wordt verbrand, is die verbranding bijna nooit 100% perfect. Als er te weinig zuurstof is of de temperatuur is niet optimaal, splaatsen moleculen zich verkeerd en herstructureren ze zich tot PAK's.

Werking: lichaamsvreemde stoffen (xenobiotica) → PAK’s → activeren en versnellen hun eigen afbraakproces

1. Binnenkomst en het alarm (Ah-receptor)

• De PAK's (weergegeven als de rode driehoekjes links) dringen de cel binnen. Omdat ze lipofiel (vetoplosbaar) zijn, passeren ze gemakkelijk het celmembraan.

• In het cytoplasma (het groen gemarkeerde deel van de cel) binden de PAK's aan een specifieke receptor: de Ah-receptor (Arylhydrocarbon-receptor, het blauwe boogje).

2. Activatie in de celkern (Geninductie)

• Zodra de PAK aan de Ah-receptor bindt, verandert de vorm van de receptor en reist dit complex samen naar de celkern (nucleus, het gestreepte vak).

• In de celkern werkt dit complex als een transcriptiefactor. Het bindt aan het DNA op specifieke plekken (de gele blokjes) vlak voor het CYP450-gen en het UGT-gen.

• Dit zet de genen 'aan' (inductie), waardoor er een blauwdruk wordt gemaakt: CYP450-mRNA en UGT-mRNA.

3. Productie van de afbraakenzymen

• Het mRNA verlaat de celkern weer. In het cytoplasma wordt dit mRNA vertaald naar functionele eiwitten. Dit zorgt voor een enorme boost in de productie van twee soorten enzymen:

  • CYP450 (Cytochroom P450; de oranje ovaal) $\rightarrow$ Fase I enzym

  • UGT (UDP-glucuronosyltransferase; de roze ovaal) $\rightarrow$ Fase II enzym

---

4. De Biotransformatie (Onderkant van de dia)

Nu de cel vol zit met deze enzymen, kan de daadwerkelijke afbraak van de overige vrije PAK's beginnen. Dit verloopt via de klassieke twee fasen:

• Fase I (via CYP450): Het CYP450-enzym pakt een PAK-molecuul en plakt er een hydroxylgroep (-OH) aan vast. Dit heet functionalizatie. Het molecuul wordt hierdoor al iets minder vetoplosbaar.

  • Toxicologische kanttekening: Hoewel het doel afbraak is, kan deze Fase I-stap er soms juist voor zorgen dat er een zeer reactief tussenproduct (epoxide) ontstaat dat schadelijk is voor het DNA (bioactivatie).

• Fase II (via UGT): Om het molecuul écht onschadelijk en uitscheidbaar te maken, neemt het UGT-enzym het over. UGT koppelt een suikermolecuul (glucuronzuur, weergegeven als -O-Gluc) aan de -OH groep. Dit proces heet conjugatie.

Het eindresultaat

Door de koppeling met glucuronzuur (-O-Gluc) is de oorspronkelijk vetoplosbare, gevaarlijke PAK veranderd in een extreem wateroplosbare (hydrofiele) stof. Hierdoor kan de stof niet meer zomaar cellen binnendringen en kan het lichaam de stof via de urine of de gal/ontlasting veilig uitscheiden.

Pyreen

• 1 van meest voorkomende PAK’s

• Niet mutageen (veroorzaakt dus geen mutaties)

• Indicator voor blootstelling aan PAK’s

Benzo(a)pyreen

• Meest bestudeerde PAK

• Mutageen, dus carcinogeen

Bioactivatie van benzo(a)pyreen: verandering van een ‘milde stof’ tot een ‘kankerverwekkend monster’

Het stappenplan van de bioactivatie (Bovenste rij)

1. Benzo[a]pyreen & de 'Bay region': Je begint links met benzo[a]pyreen, een beruchte PAK uit onder andere tabaksrook en dieseluitlaat. Let op de pijl die naar de 'Bay region' (de baai-regio) wijst. Dit is een specifieke, ingesloten holte in de ringstructuur (tussen positie 10 en 11). Deze regio is chemisch gezien cruciaal voor de toxiciteit.

2. Stap 1: P450 (Epoxidatie): Het enzym CYP450 probeert de stof wateroplosbaar te maken door er een zuurstofatoom aan te plakken. Hierdoor ontstaat er een zogeheten epoxide (het rode driehoekje met de 'O' onderaan de ring).

3. Stap 2: Epoxide hydrolase: Een ander enzym, epoxide hydrolase, breekt deze reactieve epoxide-ring snel open en voegt er water aan toe. Hierdoor verandert de epoxide in twee milde hydroxylgroepen (-OH). De stof die nu ontstaan is, heet een dihydrodiol.

4. Stap 3: Nogmaals P450 / PHS (De fatale stap): Nu gaat het mis. CYP450 (of PHS) valt de molecuul nog een keer aan, maar nu precies op de plek vlak naast de 'Bay region' (positie 9-10). Er wordt opnieuw een epoxide-ring gevormd (het rode driehoekje linksboven).

Het eindproduct is benzo(a)pyreen-diol epoxide (BPDE).

---

Waarom is BPDE zo gevaarlijk?

Door de unieke vorm van de Bay region zit de nieuwe epoxide-ring heel erg 'beschermd' ingebouwd. Hierdoor kan het opruimenzym (epoxide hydrolase) er niet meer goed bij om hem onschadelijk te maken.

Het molecuul is nu een extreem agressief elektrofiel geworden: het zoekt wanhopig naar elektronen om stabiel te worden. En waar zitten die elektronen in overvloed? In je DNA.

Wat gebeurt er als benzo(a)pyreen-diol epoxide (BPDE) de celkern binnendringt?

De DNA-adduct (Het blauwe kader rechtsonder)

Het kader rechtsonder laat zien wat er gebeurt als BPDE de celkern binnendringt:

• Het BPDE-molecuul reageert direct met een guanine-base (een van de letters van de genetische code, de 'G') van het DNA.

• Er wordt een permanente, sterke covalente binding gevormd tussen het DNA en de PAK. Dit chemische complex noem je een DNA-adduct.

• Het gevolg: Zo'n grote 'vlek' op het DNA blokkeert en vervormt de DNA-streng. Wanneer de cel zich wil delen en het DNA gaat kopiëren, kan de polymerase-eiwit de code niet meer goed lezen. Dit leidt tot fouten (mutaties). Als deze mutaties plaatsvinden in vitale genen (zoals tumor-suppressorgenen of oncogenen), kan dit het begin zijn van het ontstaan van kanker.

Oxidatieve stress

= een toestand waarin er in de cel een disbalans is tussen de productie van reactieve zuurstofverbindingen (ROS / vrije radicalen) en het vermogen van de cel om deze schadelijke stoffen met antioxidanten (zoals glutathione of vitaminen) op te ruimen.

Vrije radicalen zijn moleculen met een onbepaald/onbepaard elektron, waardoor ze extreem reactief zijn. Als er te veel van zijn, gaan ze 'vandaliseren' in de cel: ze beschadigen celmembranen (lipideperoxidatie), breken eiwitten af en veroorzaken breuken in het DNA.

Oxidatieve stress: oxidatie van hydroquinonen

1. De Bovenste Rij: Van Hydroquinon naar Quinon

Wanneer het enzym CYP (Cytochroom P450) de PAK aanpakt, kan er een H2Q (Hydroquinon) ontstaan. Dit molecuul heeft twee hydroxylgroepen ($-OH$).

• Het hydroquinon kan elektronen verliezen (oxideren).

• Eerst verliest het één elektron en verandert het in een Semiquinon. Let op de stip: dit geeft aan dat het een vrij radicaal is geworden.

• Vervolgens verliest het nóg een elektron en verandert het in een (Quinon), met twee ketongroepen (

• =O).

2. Het kader linksonder: De Redox Cycle (De vicieuze cirkel)

Dit schema laat zien waarom deze reactie zo gevaarlijk is. Het is namelijk geen eenrichtingsverkeer, maar een cirkel (redox cycling):

• Terwijl $H_2Q$ oxideert tot $S^{\bullet-}$ en uiteindelijk tot $Q$, worden de losgekomen elektronen gretig afgegeven aan gewone zuurstof ($O_2$) die in de cel aanwezig is. Die zuurstof verandert daardegen in superoxide ($O_2^{\bullet-}$), een gevaarlijk radicaal.

• Het probleem: Het gevormde Quinon ($Q$) kan door andere enzymen in de cel (zoals cytochrome P450 reductase) weer worden gereduceerd (teruggedraaid) naar Semiquinon en Hydroquinon.

• Dit betekent dat dit molecuul telkens heen en weer blijft transformeren. Bij elke herhaling van deze cirkel wordt er telkens opnieuw $O_2$ omgezet in schadelijke radicalen ($O_2^{\bullet-}$). Zolang er zuurstof en energie in de cel is, blijft deze fabriek draaien.

3. Het kader rechtsonder: De vorming van 'Nieuwe' ROS

Dit blok laat de chemische kettingreactie zien die volgt nadat het eerste superoxide-radicaal ($O_2^{\bullet-}$) is gevormd door de redox-cirkel:

1. $$O_2 + e^- \rightarrow O_2^{\bullet-}$$

   Zuurstof krijgt een elektron en wordt Superoxide (een vrij radicaal).

2. $$O_2^{\bullet-} + H_2O \rightarrow HO_2^{\bullet} + OH^-$$

   Superoxide reageert met water en vormt het Hydroperoxyl-radicaal.

3. $$HO_2^{\bullet} + e^- + H^+ \rightarrow H_2O_2$$

   Dit reageert door tot Waterstofperoxide ($H_2O_2$). Dit is op zichzelf geen radicaal, maar wel heel toxisch (denk aan blondiermiddel).

4. $$H_2O_2 + e^- \rightarrow OH^- + ^{\bullet}OH$$

   Wanneer waterstofperoxide reageert met bijvoorbeeld losse ijzerionen in de cel (de Fenton-reactie), splitst het op in een hydroxyl-ion en het Hydroxyl-radicaal ($^{\bullet}OH$).

De toxicologische conclusie: Het hydroxyl-radicaal ($^{\bullet}OH$) onderaan de keten is de absolute 'sloper' onder de radicalen. Het reageert met werkelijk alles wat het tegenkomt in de cel. De dia laat dus zien dat de biotransformatie van PAK's niet alleen zorgt voor DNA-adducten, maar de cel ook blootstelt aan een constante stroom van deze chemische munitie.

Oxidatieve stress → DNA adduct (mutatie)

De radicalen ($^{\bullet}OH$) uit de vorige stap vallen hier het DNA aan en veranderen de base guanine in het defecte 8OH-guanine (8OH-G). Dit zorgt voor een permanente G $\rightarrow$ T mutatie.

De directe link met ontsteking werkt via deze korte vicieuze cirkel:

• 1. DNA-schade als alarmsignaal (DAMP): Wanneer cellen door oxidatieve stress volstromen met 8OH-G en mutaties, raken ze ernstig beschadigd of sterven ze af. De cel laat deze geoxideerde DNA-fragmenten (8OH-G) los in de omgeving. Het immuunsysteem herkent dit gemutileerde DNA als een gevarensignaal (een Damage-Associated Molecular Pattern of DAMP) en start direct een ontstekingsreactie om de boel op te ruimen.

• 2. De ontsteking slaat terug: De geactiveerde immuuncellen die op de ontsteking afkomen, produceren als afweerreactie nóg meer radicalen ($^{\bullet}OH$).

• 3. De vicieuze cirkel: Deze nieuwe radicalen vallen vervolgens de gezonde cellen in de buurt aan, wat daar weer leidt tot de vorming van meer 8OH-G en mutaties.

Kortom: 8OH-G is de fysieke DNA-schade veroorzaakt door oxidatieve stress, die door het lichaam wordt opgemerkt als een biologische brandhaard, waardoor een chronische ontsteking blijft loeien.

Werking van de umu reportergen-assay: hoe genotoxisch (DNA beschadigend) is een monster van luchtverontreiniging?

Stap-voor-stap: Hoe werkt de umu-assay?1. Blootstelling en DNA-schade (Linksonder)

Je neemt een monster van de luchtverontreiniging (bijvoorbeeld fijnstof-extracten vol PAK's) en voegt dit toe aan een kweek van speciaal aangepaste bacteriën. Als de luchtvervuiling genotoxische stoffen bevat, veroorzaken deze direct DNA-damage (weergegeven door de gele bliksemschicht).

2. De alarmfase: Activatie van Rec A (Links)

De bacterie merkt de DNA-schade op en activeert een SOS-signaal. Dit signaal zorgt ervoor dat het inactieve eiwit Rec A (het rode vierkant) verandert in zijn actieve vorm: *Rec A (de rode driehoek).

3. Het slot openbreken: Lex A splitsing (Midden)

Bacteriën hebben hun SOS-reparatiegenen normaal gesproken strak achter slot en grendel zitten om energie te besparen. Dit 'slot' is het repressor-eiwit Lex A (het paarse blokje). Het geactiveerde *Rec A reist naar Lex A toe en zorgt voor repressor splitting: het knipt het slot doormidden.

4. De fabriek start: Transcriptie van het reportergen (Rechts)

Nu Lex A is uitgeschakeld, ligt de weg vrij voor de RNA-polymerase. De bacterie start direct met de transcription en translation van de achterliggende genen.

• In deze genetisch gemodificeerde bacterie is het UMU-gen (dat normaal de SOS-reparatie regelt) gekoppeld aan het lac Z-gen uit een andere bacterie.

• Dit lac Z-gen fungeert als ons reportergen: het produceert het enzym $\beta$-galactosidase (de groene bolletjes).

5. De meting: Kleurreactie (Rechtsonder)

Om de uitslag te kunnen zien, voegen we aan het medium een kleurloos substraat (S) toe. Het vers gemaakte enzym $\beta$-galactosidase stort zich op dit substraat en zet het om in een gekleurd (meestal geel) product (P).