Protéomique quantitative

Qu’est-ce que la protéomique

·       Terme apparu en 1994

·       Le protéome désigne l’ensemble de protéines codées par le génome.

·       La protéomique vise à identifier et quantifier toutes les protéines d’une protéome en fonction du temps, de l’espace et du type cellulaire, en incluant l’expression, la localisation cellulaire, les interactions, les PTMs et le turnover.

Protéomique quantitative basée sur le gel : Focalisation isoélectrique et 2D-DIGE

La focalisation isoélectrique est une méthode utilisée pour séparer les protéines en fonction de leur point isoélectrique. Le point isoélectrique est le pH auquel une protéine n’a pas de charge nette. À ce moment, elle est appelée zwitterion et elle ne se déplace pas dans un champ électrique car elle est neutre.

Dans la focalisation isoélectrique, les protéines sont placées dans un gel contenant un gradient de pH et exposées à un champ électrique. Chaque protéine migrera à travers le gel jusqu'à ce qu'elle atteigne le pH qui correspond à son propre pI. À ce pH, la protéine cesse de se déplacer car sa charge nette est zéro.

Une fois que les protéines sont séparées par charge, le gel est utilisé dans une deuxième étape :  SDS PAGE électrophorèse, qui sépare les mêmes protéines par leur poids moléculaire.

2D DIGE (Électrophorèse sur gel de différence en deux dimensions) :

Deux échantillons sont marqués séparément avec des fluorophores différents (Cy3, Cy5), mélangés, puis co-migrés sur un même gel 2D. Dans la première dimension, les protéines sont séparées selon leur pI et dans la deuxième, selon leur poids moléculaire. Le gel est ensuite scanné spot par spot. Chaque spot de protéine apparaît dans une couleur spécifique selon l'échantillon d'où il provient. Si la même protéine est présente dans les deux échantillons, le spot apparaîtra jaune (un mélange de rouge et de vert). L'intensité (luminosité) de la couleur montre combien de cette protéine est dans chaque échantillon.

Forces :

·       Amélioration du manque de reproductibilité des simples gels 2D puisqu’il n’y a pas de variations de supports

·       Séparation de portéines très proches, y compris de gènes identiques avec des PTM différentes

·       Faible complexité par spot.

Faiblesses :

·       Résolution insuffisante pour un protéome complexe

·       Faible gamme dynamique (3 à 4 ordres seulement, alors que le sérum couvre 10 à 13 ordres)

·       Protéines membranaires difficiles à analyser

·       Méthode longue

·       Identification spot par spot nécessaire

·       Co-migration possible de plusieurs protéines dans un même spot rendant la quantification inexacte.

→ Plus utilisée

Évolution de la LC

• 1995 : la LC-MS/MS devient capable d'analyser des mélanges peptidiques complexes.

• 1996 : apparition du NanoESI, augmentant la sensibilité à l'échelle femtomolaire (aujourd'hui attomolaire), ce qui ouvre la voie à la protéomique gel-free.

• 2001 : 2D-HPLC & nanoHPLC couplé à nanoESI-MS

• 2004 : UPLC (pression élevée, résolution améliorée)

• 2009 : nanoUPLC

Gel-based vs Gel-free

Workflow gel-based :

·       Extraction du tissu ou cellules

·       Enrichissement : certains types de protéines doivent être enrichies pour améliorer la détection

·       2DE pour séparer/quantifier

·       Digestion : les spots de protéines sont excisées du gel et digérer enzymatiquement en peptides

·       Identification par MALDI-TOF.

Workflow gel-free :

·       Extraction & enrichissement

·       Digestion : toute le mélange protéique est digéré en peptides sans séparation par gel

·       Séparation par LC en fonction de leur hydrophobicité

·       Analyse ESI-MS/MS pour identification et quantification simultanées.

Mode d'acquisition typique : DDA (Data Dependent Acquisition) où le spectromètre sélectionne automatiquement les N précurseurs les plus intenses (Top N, ex. Top 3) à chaque cycle MS pour les fragmenter en MS/MS.

Sur le graphique, chaque pic correspond à un ion peptide et leur hauteur à l’abondance de cet ion.

Quantification par marquage isotopique stable

Deux grandes familles :

• In vivo (marquage métabolique) : nutriment isotopique incorporé pendant la croissance cellulaire (SILAC, marquage ¹⁵N).

• In vitro (marquage chimique) : réactif isotopique appliqué après extraction (ICAT, ICPL, mTRAQ), ou réactif isobarique quantifiable en MS/MS (TMT, iTRAQ).

  • Niveau peptidique, pas protéique

Réactifs non-isobariques quantification en MS (labeling chimique)

1)     Étiquetage : Les protéines ou peptides de chaque condition sont étiquetés avec une étiquette chimique (tag léger pour un échantillon, tag lourd pour un autre). Ces étiquettes ont les mêmes propriétés chimiques mais de masse différentes.

2)     En LC, elles coéluent ensemble grâce à leur propriétés physico-chimiques similaires.

3)     En MS, elles génèrent deux pics m/Z différents. L’intensité des pics reflètent l’abondance relative du peptide dans chaque condition.

C’est une technique utile pour lancer plusieurs molécules sur un seul run et élimine donc le manque de reproductibilité entre les runs.

1999 : Isotope Coded Ajnity Tag (ICAT)

Le réactif ICAT a trois composants principaux :

-       Groupe réactif thiol : Ce groupe se lie spécifiquement au groupe thiol (SH) des résidus de cystéine dans les protéines.

-       Lien isotopique : Cette partie contient soit des isotopes légers (hydrogène) soit des isotopes lourds (deutérium), créant une différence de masse entre les deux échantillons.

-       Étiquette biotine : Permet la purification sélective des peptides marqués par chromatographie d'affinité (en utilisant de la streptavidine ou de l'avidine). 

Après le marquage :

• Les deux échantillons de protéines (légers et lourds) sont mélangés.

• Les protéines marquées sont digérées en peptides.

• Les peptides marqués à la biotine sont purifiés.

• Les peptides sont analysés par LC MS (Chromatographie Liquide – Spectrométrie de Masse).

• L'abondance relative de chaque peptide est déterminée en comparant les intensités des pics légers et lourds. 

Limites : le deutérium provoque un léger décalage d’élution en LC (effet isotopique)

2003 : cICAT

Le deutérium est échangé par du carbone 13 qui présente une co-élution parfaite. La biotine devient clivable pour limiter l’augmentation de masse et faciliter la fragmentation

2005 : ICPL

Cela réagit sur les groupes amines (N-term et lysines) et augmente donc le nombre de peptides qui peuvent être étiquetés.

Forces et faiblesses des réactions non-isobariques

Forces :

·       Quantification directe en MS avec plusieurs points de mesure le long du pic chromatographique (aire sous la courbe)

·       Mélange lourd/léger possible avant toute préparation pour Silac

·       Purification par affinité avec ICAT

 

Faiblesses :

·       Doublement de la complexité spectrale (light + heavy pour chaque peptide)

·       ICAT limité aux protéines à cystéine

·       Effet de deutérium si tag deutéré

·       SILAC limité aux cultures cellulaires

·       ICPL sur lysines interfère avec la digestion trypsinique

Réactifs isobariques (quantification en MS/MS)

Tous les tags ont la même masse totale (isobarique) et comportent un groupe balance et un groupe rapporteur en proportion variable + un groupe réactif amine qui se lie aux protéines. Les peptides marqués issus de différentes conditions apparaissent à un seul m/z en MS et coéluent.

→ Lors de la fragmentation MS/MS, chaque tag perd le groupe balance neutre et garde l’ion rapporteur qui est chargé.

→ L’ion rapporteur permettra donc la quantification relative et l’identification et l’intensité reflète l’abondance d’un peptide dans un échantillon

Avantages

-       L’avantage majeur est le multiplexage (jusqu’à 16 échantillons) sans augmenter la complexité spectrale en MS.

-       Il réduit le temps d’analyse.

-       Tous les peptides ont le même m/z, ce qui facilite la coélution et la co-isolation pour MS/MS

Inconvénients

-       Cela nécessite un instrument avec une bonne résolution en MS/MS pour distinguer les ions rapporteurs proches

-       Précision de quantification limitée par la compression des ratios (la fenêtre d’isolation m/z est large, plusieurs peptides co-isolés génèrent des ions rapporteurs qui se mélangent)

-       Une seule mesure par peptide (pas d’aire sous la courbe comme pour la marquage isobarique)

 

·       2003 : TMT

·       2004 : iTRAQ

Quantification label-free

Ce méthode permet de quantifier les peptides sans marqueur chimique ou isotopique, en mesurant directement l’intensité du signal ou par comptage spectrale. Elle permet de comparer différents échantillons indépendants.

• Q-TOF (1997) : combine un quadrupôle qui sélectionne un ion précurseur et la haute résolution du TOF

• 2D-nano-HPLC/UPLC (2001-2009)

• Lockspray : correction de la m/z spectre par spectre, améliore la précision de masse

• La première méthode sans marquage a été réalisée en 2005 dans la biologie des systèmes

DDA (Data Dependent Acquisition)

À chaque cycle, le spectromètre fait un MS complet et détecte tous les ions, puis sélectionne les N précurseurs les plus intenses (top 10 typiquement) pour les fragmenter en MS/MS.

→ Le choix des précurseurs étant stochastique (dépend des intensités à l’instant t), la même expérience reproduite ne refragmente pas exactement les mêmes peptides

• Problème de variabilité inter-run (missing values entre réplicats)

• Comme les peptides de faible abondance sont souvent ignorés, la DDA passe à côté de nombreux peptides.

Distribution des peptides : pourquoi DDA est limité ?

Lorsque l’ensemble du protéome est digéré par la trypsine, cela génère des milliers de peptides, se terminant généralement par une lysine ou de l’arginine et qui présentent une masse moléculaire autour de 1000 Da (gamme de 600 à 4600 Da).

• En chromatographie, 466 peptides/secondes peuvent être co-élués sur un gradient typique (13 à 90 minutes), ce qui signifie qu’ils rentrent dans la spectromètre en même temps

• La plupart du temps, plus de deux peptides sont co-isolés et fragmentés simultanément ce qui créent des spectres chimériques difficile à interpréter sans erreur

DIA (Data-Independent Acquisition)/SWATH

Au lieu de sélectionner sélectivement les précurseurs, la DIA fragmente de manière systématique tous les ions dans des fenêtres m/z prédéfinies sur toute la gamme de masse. Les ions de faible abondance passent à la casserole.

• Cycle de 1-2 secondes en MS (appelé cycle de « service ») puis MS/MS

• Pas de sélection au quadrupôle

• Triage bio-informatique ultérieur

Conditions :

·       Haute précision de masse

·       Haute résolution chromatographique

Avantages :

·       Améliore la rapport signal/bruit d’un facteur 3 à 5 par rapport à la DDA

·       Supprime la variabilité inter-run

·       Couverture élevée, aucune préférence pour les peptides à forte abondance

·       Typiquement utilisé avec nanoLC multidimensionnelle afin d’améliorer la séparation des peptides

SWATH (AB Sciex, 2011) 

La gamme m/z complète est divisée en fenêtres séquentielles de 25 amu chacune.  1 amu (unité de masse atomique) = 1 Da (Dalton) = 1 unité de masse m/z (masse/charge) Dans chaque fenêtre, les ions sont sélectionnés et fragmentés ensemble. L’instrument recueille les spectres MS/MS pour chaque fenêtre, ce qui donne une série de spectre de fragment.

DIA Waters (MS^E) 

Il s’agit d’une alternance entre des balayages MS à faible énergie et des balayages MS à haute énergie pour capturer à la fois les données des ions précurseurs et les ions fragmentés.

Workflow :

·       Échantillon protéique

·       Digestion tryptique

·       Injection sur ESI-Q-TOF

·       Acquisition parallèle MS de basse énergie (précurseurs) et de haute énergie (fragments)

-       Alterne toutes les deux secondes

·       Analyse en triplicata

Visualisation des données : Nuage de points (m/z vs temps de rétention) pour les données de low erney (précurseurs, en rouge) et high energy (fragments en bleu).

→ L’alignement du temps de rétention et les profils d’intensité entre précurseur et fragment (même temps de rétention) permettent d’attribuer les fragments à leur précurseur. Ce procédé est considérablement amélioré grâce aux progrès de l’IA et de la bio-informatique. Les outils utilisent désormais des bibliothèques spectrales, qui stockent les profils de fragmentation de référence pour des peptides connus.

Traitement itératif :

1.     La protéine la mieux classée est identifiée en fonction de la qualité et du nombre d’ions fragmentaires correspondants.

2.     Les ions précurseurs et fragments qui ont été attribués à cette protéine sont supprimés

3.     La protéine suivante est identifiée sur le dataset déplété

4.     Ainsi de suite jusqu’à ne plus atteindre les critères minimums d’identification

Validation par QC 

Quantification absolue par LC-MS^E

En spectrométrie de masse, les peptides issus de différentes protéines sont analysés via leurs signaux d'intensité. Cependant, chaque peptide ionise différemment selon sa séquence, ce qui signifie qu'on ne peut pas comparer directement l'intensité de deux peptides différents — même en quantité égale, ils produiront des signaux différents. Graphiquement, cela se traduit par une courbe en décroissance exponentielle.

→ Principe TOP3 : la somme (ou la moyenne) des intensités des trois peptides les plus intenses d’une protéine est proportionnelle à la quantité absolue, à condition d’avoir un standard interne de concentration connue

• Permet la quantification absolue en pmol avec erreurs typiquement <5% sur un mélange de 6 protéines connues

• Le ration signal/pmol moyen sert de facteur de normalisation universel

Mobilité ionique HDMS^E (High Definition)

= Ajout d’une troisième dimension de séparation orthogonale à la LC et au m/z dans une cellule de mobilité replie d’hélium : la section de collision qui dépend de la taille et la forme de l’ion en phase gazeuse. « Les molécules les plus grosses sortent en premier car elles ont plus de vents dans le dos ». Les ions précurseurs sont ensuite envoyés vers le TOF avec ou sans fragmentation. L’analyse par TOF est très rapide (microseconde), la résolution de la mobilité (millisecondes) et de l’élution (secondes) sont conservées.

• Sépare les ions de même m/z mais de forme différentes

• Exemple : cette technique permet de discriminer les ions isobares qui coluent en LC

• Réduit drastiquement la complexité des specters chimériques

• Les précurseurs et leurs fragments sont alignés temporellement sur le drift/time ce qui améliore la fiabilité de l’attribution précurseur/fragment

• Amélioration de l’identification et quantification dans les approches HDMSE

Représentation en 3D : chaque peptide devient un point dans l’espace (temps de rétention LC, drif time mobility, m/z), ce qui permet de résoudre des peptides indissociables en LC-MS classiques. Aujrd’hui, la dimension supplémentaire est disponible dans tous les spectromètres.

La mobilité ionique permet également de séparer les molécules selon leur état de charges et rend donc possible l’élimination des molécules parasites monochargées. Elle garde uniquement les peptides doublement chargés ou plus.

Label-free : forces et limites

Forces :

·       Pas de limites sur le nombre d’échantillons comparables

·       Aucune préparation. Supplémentaire pour la quantification

·       Possibilité de quantification absolue à condition d’ajouter une quantité connue d’étalon (logique Top3)

-       Cependant, une vraie quantification absolue nécessite des étalons internes marqués par des isotopes stables.

Limites :

·       Durée d’analyse plus long car les échantillons doivent passer un par un (pas de multiplexage)

Stable Isotope Dilution (SID)

= Seule méthode fiable de quantification absolue en MS, qui est inspirée de l’analyse des petites molécules en 1980. C’est une approche ciblée ce qui signifie que les chercheurs savent ce qu’ils cherchent et utilisent cette technique pour la validation d’un biomarqueur ou d’une hypothèse de phase de découverte.

·       On ajoute à l’échantillon une quantité connue d’une version marquée isotopiquement (¹³C et/ou ¹⁵N) d’un peptide ou d’une protéine cible, qui se comporte de manière identique pendant l’analyse mais à une masse différente.

·       On compare l’intensité du signal léger (endogène) vs lourd (standard interne) pour obtenir de véritables valeurs de concentration molaire.

Choix du peptides rapporteurs

La quantification se fait un niveau du peptide qui doit être protéotypique (unique à la protéine cible) et facilement détectable par MS.

→ Cependant, les mêmes peptides tryptiques issus de la même protéine peuvent produire des intensités de signal très différentes, pouvant varier jusqu’à 100 fois, en raison de différences dans la capacité à s’ioniser.

→ Pour choisir le meilleur peptide, la sélection s’appuie sur des analyses antérieures, des bases de données publiques tels que PeptideAtlas ou des outils prédictifs

Critères clés

• Spécifique de la protéine

• Ionisable

• Longueur et hydrophobicité adaptées

• Stable chimiquement - Absence de résidus sujets aux PTMs ou aux modifications artéfactuelles

• Ces peptides doivent être quantotypiques, càd systématiquement libérés lors de la digestion par la trypsine et qui est bien adapté à la quantification

→ En pratique, on sélectionne 3-5 peptides par protéine, puis on les fait synthétiser par une entreprise

Workflow en deux temps :

·       Quantification relative : identification des protéines candidates

·       Quantification absolue : valider et quantifier précisément avec des peptides synthétiques

Mode d’acquisition SRM

Le Selected Reaction Monitoring fonctionne en sélectionnant une transition spécifique :

Ion parent (Q1) → fragmentation (Q2) → Ion fragment/fille (Q3)

• Q1 filtre le peptide d'intérêt selon son m/z

• Q2 le fragmente (triple quadrupôle)

• Q3 filtre un fragment spécifique et mesure son intensité

La version multiplexé est le MRM (Multiple Reaction Monitoring). Parmi les variantes, on retrouve MRM³, qui utilise un piège linéaire pour une sélectivité accrue, ainsi que les approches à haute résolution comme le système Orbitrap.

Différents types de standard de référence

Standard	Nature	Avantage	Limite
AQUA (Gerber)	Peptides synthétiques marqués avec un isotope lourd 13C ou 15N après la digestion	Simple, peu couteux	Ne contrôle ni la digestion ni les modifications artéfactuelles → Suppose que la digestion est la même pour les deux isotopes
QConCAT (Pratt)	Protéines artificielles composés de multiples peptides concaténés, exprimés et marqués métaboliquement	Ajouté avant digestion → Utile pour le multiplexage	Environnement de digestion différent de la protéine native
PSAQ (Brun)	Protéine recombinante entière marqué avec 13C ou 15N	Suit toutes les étapes dans les mêmes conditions que l’endogène	Coût élevé, inadapté aux protéines à PTMs