N°1 Exploration de la réponse immunitaire et outils immuno en biologie médicale

Quels sont les 2 manières d’utiliser les anticorps dans l’analyse immuno ?

• Comme outil biologique : permet d’identifier la cellule ou la molécule impliquée dans la maladie = diagnostic 

• Comme molécule cible à détecter : mettre en évidence des anticorps présents dans le sang = sérologie 

Quelles sont les fonctions des anticorps ?

• Opsonisation : Ac se fixe sur une molécule de surface d’une bactérie, la recouvre entièrement, facilitant la phagocytose 

• Cytotoxicité dépendante des anticorps = ADCC 

• Activation du complément : soit à une réponse inflammatoire, soit à la formation d’un complexe d’attaque membranaire pour la destruction de bactéries 

Qu’est ce que les anticorps polyclonaux ?

Mélange d’Ig différentes reconnaissant plusieurs épitopes d’un même Ag cible 

Qu’est ce que les anticorps monoclonaux ?

Création artificielle dont l’objectif est de produire un Ac reconnaissant un seul épitope 

On fusionne des plasmocytes avec des cellules myélomes (cellules tumorales) immortelles. Cela donne un hybridome qui constitue une source infinie d’Ac

Qu’est ce que le sérum polyclonal ?

Mélange d’Ac dirigés contre une cible précise 

Ex :  sérum anti-lymphocyte T, utilisé en cas de greffe pour diminuer les LT du receveur = traitement immunosuppresseur 

Qu’est ce que les immunoglobulines polyvalentes intraveineuses ?

(IvIG) : Ac purifiés à partir de plasma de donneurs de sang constituant un pool d’Ac polyclonaux 

• Traitement des déficits immunitaires : restaurer l’immunité 

• Traitement immunomodulateur : sert à  calmer un système immunitaire hyperactif 

Quelles sont les 2 méthodes qui utilise les Ac comme outil de détection ?

Méthode qualitative : mettre en évidence un Ag donné dans un milieu liquide ou un substrat solide 

Méthode quantitative : dosage d’un Ag dans un milieu liquide, ce qui permet de mesurer la concentration 

Quels sont les types d’anticorps pouvant être recherchés ou détecter par d’autres anticorps ?

• Auto-anticorps : maladie d’auto immune

• IgE : maladie allergique

• Anticorps anti infectieux : sérologie bactérienne et virale

Quels sont les 2 types d’immunomarquage ?

• direct : Ac dirigé contre l’Ag porte directement le marqueur. Révélation en une seule étape 

• indirect : avec un Ac primaire et un Ac secondaire. Le secondaire reconnaît le primaire et porte le marqueur. Meilleure sensibilité et amplification du signal 

Qu’est ce que les ANCA et leurs conséquences ?

ANCA : auto anticorps qui s’attaquent aux neutrophile

Lésions inflammatoires aux petits vaisseaux et atteintes multi organes

Quelle est la méthode de détection et les étapes pour détecter les auto anticorps dans la vascularite à ANCA ?

Méthode de détection : Immunofluorescence indirecte 

• Incubation du sérum du patient avec des polynucléaires neutrophiles humains

• Si ANCA, ceux ci se fixent sur le cytoplasme des neutrophiles

• Révélation avec un anticorps secondaire anti IgG humain couplé à un fluorochrome 

Qu’est ce que le pemphigus vulgaire et la méthode de détection des dépöts d’anticorps dans la maladie ?

Maladie auto-immune avec des auto-anticorps contre les desmosomes qui assurent la jonction entre les kératinocytes. Provoquent des lésions bulleuses entre l’épiderme et le derme

Méthode de détection à immunofluorescence directe 

• Incubation de la coupe de biopsie avec un anticorps anti-IgG couplé à un fluorochrome

Qu’est ce que permet de déterminer la cytométrie en flux ?

Paramètres morphologiques :  

• La déviation du laser quand une cellule passe devant renseigne sur la taille et la granularité de chaque cellule ainsi que la structure interne

• Permet d’identifier et quantifier les grandes populations cellulaires 

• => NFS 

Phénotypage cellulaire : 

• Marquer les cellules avec un ou plusieurs anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes

• Le laser excite les fluorochromes

• Permet d’analyser quantitativement les marqueurs de surface caractéristiques des sous populations lymphocytaires ou myéloïdes 

• Résultats représentés sous 2 formes : 

  • Histogramme de fluorescence 

  • Dot plot : permet d’identifier les cellules doublement positif, simplement positif ou négatif pour 2 marqueurs 

Quel est le principe de la méthode sandwich ?

2 anticorps reconnaissant le même antigène mais ciblant 2 épitopes différents 

Etapes : 

• Dépôt de l’Ac de capture 

• Lavage 

• Ajout de l’échantillon 

• Lavage

• Ajout de l’Ac de détection avec un marqueur 

Quel est le principe de la méthode ELISA ?

Méthode ELISA : 

• Fixation de l’Ac de capture 

• Ajout du liquide biologique 

• Lavage

• Ajout de l’Ac de détection 

• Ajout d’un substrat chromogène : en présence de l’enzyme, le substrat génère une coloration dont l’intensité est proportionnelle à la quantité d’Ag présents 

• Lecture spectrophotométrique : densité optique (DO) 

Comment on fait le dosage pondéral des Ig ?

Permet de quantifier les Ig selon leur chaîne lourde 

Méthode : néphélomètre ou turbidimétrie 

A certaines concentrations d’Ac et d’Ag, les complexes Ag/Ac forment un réseau qui précipite en milieu liquide 

Adapté pour un dosage de grandes quantités d’Ac

Qu’est ce que l’électrophorèse des protéines sériques, indications ?

Technique de migration des protéines du sérum sous l’effet d’un courant électrique 

Indications : évaluation du statut nutritionnel et inflammatoire, exploration d’une atteinte hépatique ou  recherche d’une gammapathie monoclonale 

Chez un sujet sain, les Ig forment le pic gamma 

Gammapathie monoclonale comme le myélome : pic gamma 

Quels sont les dosages à faire en première intention pour le complément + indications ?

En première intention : dosage de C3 et C4

Indication : déficit immunitaire ou consommation anormale des protéines du complément 

Néphélométrie ou turbidimétrie

Quel est le teste à faire pour doser le complément en deuxième intention ?

Test fonctionnel CH50 explore la capacité fonctionnelle globale du complément 

Indications : suspicion d’hypocomplémentémie, défaut de synthèse ou excès de consommation du complément 

Qu’est ce que permet de rechercher un hémogramme lors d’une réaction inflammatoire ?

Anémie inflammatoire 

• Taux d’hémoglobine abaissée

• Anémie normocytaire puis microcytaire

• Absence de carence martiale

• Ferritine normale ou augmentée 

Potentiellement : 

• hyperleucocytose

• thrombocytose 

Quelles sont les protéines dont la synthèse est augmentée durant la réponse inflammatoire ?

Synthèse augmentée

• CRP : produite par les hépatocytes sous l’action de IL-6 

• Haptoglobine : rôle de fixer l'hémoglobine fixe 

• Orosomucoïde

• Fibrinogène : impliquée dans la coagulation 

Quelles protéines sont diminuées lors de la réponse inflammatoire ?

Synthèse diminuée : 

• Albumine 

• Transferrine