Chapitre 8 : Souris KIKO

Pourquoi génère-t-on des souris génétiquement modifiées (GEM) ?

Pour déterminer la fonction d’un gène chez la souris.

Quelles sont les principales techniques utilisées pour étudier la fonction d’un gène chez la souris ?

1⃣ Loss of function (LoF) → Knock-out (KO)
2⃣ Gain of function (GoF) → Knock-in (KI)
3⃣ Knock-down
4⃣ Tracing

Qu’est-ce qu’un Knock-out (KO) ?

👉 Inactivation complète d’un gène
👉 Par délétion ou mutation ciblée

Comment peut-on inactiver un gène dans un modèle KO ?

👉 En remplaçant le gène
👉 Ou en interférant avec son expression

Quels types de KO existent ?

• Constitutive

• Conditionnel

• Inductible

Quels éléments sont utilisés pour la sélection négative lors de la génération d’un KO ?

👉 DTA (diphteria toxin A) ou TK (Herpes simplex virus 1 tyrosine kinase)
👉 Utilisés si la recombinaison ne se fait pas au bon endroit

Que contient la séquence d’ADN utilisée pour créer un KO ?

• Deux bras d’homologie (3’ et 5’)

• Un marqueur de sélection positif (NeoR)

• La séquence à insérer au locus cible

À quoi servent les sites loxP ou FRT autour du marqueur NeoR ?

👉 À permettre l’excision ultérieure du marqueur si souhaitée

• Le marqueur NeoR peut interférer avec l’expression des gènes locaux.

Dans quel type de cellules réalise-t-on initialement le KO ?

Des cellules souches embryonnaires

Quelles sont les étapes après modification des cellules embryonnaires ?

1⃣ Implantation dans le blastocyste dans une souris pseudogestante
2⃣ Sélection des souris chimériques
3⃣ Croisement avec des WT
4⃣ Identification des hétérozygotes
5⃣ Génération des homozygotes

Quel est le risque principal d’un KO global (constitutif) ?

Une perte de fonction du gène dans tout l’organisme pouvant mener à une mort embryonnaire et des conséquences subséquentes imprévisibles

Qu’est-ce qu’un Knock-in (KI) ?

👉 Ajout d’un gène ou d’une séquence
👉 → Gain de fonction

Quels types de séquences peut-on insérer dans un KI ?

👉 Gène couleur
👉 Gène toxique
👉 Gène reporter
👉 ARN (chez le zebrafish)

Que signifie le « tagging » dans un modèle KI ?

👉 Ajout d’un tag ou d’une protéine fluorescente
👉 Création d’une protéine de fusion servant de rapporteur

Quelle est la définition d’un Knock-in en biologie moléculaire ?

👉 Remplacement un-pour-un d’une séquence d’ADN
👉 Ou insertion d’une nouvelle séquence dans un locus génomique

Qu’est-ce qu’un locus génomique “safe harbour” ?

👉 Site d’intégration où l’insertion :

• N’impacte pas les gènes murins environnants

• Permet l’expression d’un gène exogène

Quel est l’intérêt d’insérer du cDNA humain dans un locus safe harbour ?

👉 Expression du gène humain
👉 À un emplacement distinct du gène murin endogène

Quel est l’exemple de locus safe harbour cité ?

👉 Rosa26
👉 Locus produisant une lncRNA

Qu’est-ce qu’un Knock-down ?

👉 Réduction de l’expression d’un gène
👉 Sans suppression complète

Quels outils sont utilisés pour le knock-down ?

👉 RNAi
👉 Morpholino (zebrafish)
👉 Gapmere
👉 shRNA

À quoi sert le tracing ?

👉 À suivre le devenir d’une cellule

Comment réalise-t-on un tracing cellulaire ?

👉 Induction permanente d’un gène rapporteur (ex : GFP)
👉 À un temps défini

Pourquoi un KO global peut-il être problématique ?

👉 Lorsqu’un gène est exprimé :

• dans plusieurs tissus,

• à différents stades du développement,

• ou à différentes étapes de la maladie,
  son invalidation globale peut être toxique ou létale.

Quelle est la solution lorsque la délétion globale d’un gène est toxique ?

👉 Invalider le gène :

• dans un tissu spécifique,

• dans un type cellulaire précis,

• ou à un moment donné.

Qu’est-ce qu’une souris KO conditionnelle ?

Une souris KO conditionnelle est une souris dans laquelle le gène est inactivé uniquement dans certains tissus ou certaines cellules (contrôle spatial), alors qu’il reste exprimé dans le reste de l’organisme.

Quel système est utilisé pour générer des KO conditionnels ?

👉 Le système Cre-LoxP

Qu’est-ce que Cre ?

👉 Une recombinase dérivée du bactériophage P1

Que reconnait la Cre ?

👉 Deux sites LoxP

De quoi est constitué un site LoxP ?

👉 Deux séquences palindromiques de 13 pb
👉 Encadrant un espace de 8 pb

Que se passe-t-il lorsque Cre reconnaît deux sites LoxP ?

👉 Cre catalyse une recombinaison entraînant :

• soit une excision,

• soit une inversion du segment,
  👉 selon l’orientation des sites LoxP

Comment obtient-on une activité Cre spécifique à un tissu ?

👉 Cre est exprimée sous le contrôle de
promoteurs cellulaires ou tissulaires spécifiques

Existe-t-il beaucoup de lignées Cre ?

👉 Oui, un grand nombre de souris Cre ont été générées
👉 Pour réaliser des KO cellule/tissu spécifiques

Quel médicament est le plus utilisé pour activer Cre ?

Tamoxifène

Quel système repose sur le tamoxifène ?

👉 Le système Cre-ER induit par le tamoxifène

Quelles autres molécules peuvent être utilisées pour contrôler Cre ?

👉 Tétracycline
👉 Doxycycline
→ systèmes TetON ou TetOFF

Sur quoi repose le système CreER ?

👉 Une recombinase Cre fusionnée à une forme mutée du
👉 récepteur aux œstrogènes (CreER)

Quelle molécule n’active pas CRE-ER

👉 À l’estradiol physiologique

Quelle molécule active CreER ?

👉 Le métabolite actif du tamoxifène

Où se trouve CreER en absence de tamoxifène ?

👉 Dans le cytoplasme, associée à HSP90

Que se passe-t-il après administration de tamoxifène ?

👉 Libération de CreER de HSP90
👉 Translocation nucléaire
👉 Reconnaissance des sites loxP
👉 Inactivation du gène ciblé
👉 Uniquement dans le tissu exprimant Cre

Quel est le principe du système tTA/Tet-Off ?

👉 Un promoteur spécifique d’un tissu dirige l’expression de tTA

Que se passe-t-il en absence de tétracycline ?

👉 tTA se fixe sur l’élément TRE
👉 Active l’expression du transgène

Que se passe-t-il en absence de tétracycline ?

👉 La tétracycline empêche tTA de se lier au TRE
👉 L’expression du transgène est bloquée
👉 Le système est OFF

À quoi d’autre peut servir le système Cre-Lox ?

👉 Induire la mort de cellules spécifiques via un gène toxique
👉 Induire des oncogènes

Comment le système Cre-Lox est-il utilisé pour le traçage de lignée & analyse clonale?

👉 Activation d’une enzyme ou d’une protéine fluorescente après activation de Cre ou d’un système de recombinaison
👉 Marquage permanent des cellules et de leur descendance

Que permet ce marquage permanent ?

👉 Valider les lignes Cre
👉 Analyser les lignées cellulaires
👉 Repérer les cellules mutantes conditionnelles lorsqu’on combine ce système un allèle mutant conditionnel.

Sur quoi repose le modèle murin MCM-Zeg ?

👉 Croisement entre :

• une souris Myh6-mER-Cre-mER où la recombinase Cre est activé spécifiquement dans les cardiomyocytes par le tamoxifène.

• une souris ZEG avec cassette stop LacZ entourée de sites loxP

Que permet l’administration de tamoxifène dans ce modèle ?

👉 Entrée de Cre dans le noyau des cardiomyocytes
👉 Retrait de la cassette stop
👉 Expression de la GFP sous le promoteur β-actine

• Les cardiomyocytes deviennent alors fluorescents verts.

Que devient le marquage après infarctus du myocarde ?

👉 Diminution d’environ 40 % des cardiomyocytes GFP+
👉 Réapparition de cellules LacZ+, suggérant la formation de nouvelles cellules à partir de progéniteurs.

Quelle conclusion est tirée avec l’injection de cellules c-kit+ ?

👉 Accentuation de la baisse des cardiomyocytes GFP+
👉 Contrairement aux cellules souches mésenchymateuses
👉 Seules les cellules c-kit+ (issues de la moelle osseuse) activent des progéniteurs endogènes

Qu’est-ce que le modèle « confetti mice » ?

👉 Chaque cellule exprime aléatoirement une couleur
👉 RFP, YFP ou CFP
👉 Palette étendue car chaque copie du transgène peut exprimer une couleur différente

À quoi sert le système Confetti ?

👉 Lignage unicellulaire
👉 Traçage clonal

Que permet ce système concrètement ?

👉 Suivre la contribution de cellules individuelles
👉 Observer l’expansion et l’organisation des clones
👉 Visualiser la dynamique cellulaire dans des tissus complexes
(cerveau, intestin, peau, muscle)

Quel est le rôle du système CRISPR-Cas chez la bactérie ?

👉 Mécanisme de défense adaptatif contre les phages

Que contient le locus CRISPR ?

👉 Des répétitions
👉 Séparées par des spacers dérivés d’ADN viral
👉 Constituant une mémoire des infections

Que se passe-t-il lors d’une nouvelle attaque virale ?

👉 Les spacers sont transcrits en crRNA
👉 Les crRNA guident les protéines Cas
👉 Vers l’ADN envahisseur portant la séquence correspondante

Quel est le rôle de Cas lors de l’infection ?

👉 La nucléase Cas coupe l’ADN étranger
👉 Neutralisation de l’infection

Quelle est la fonction globale du système CRISPR-Cas ?

👉 Acquérir
👉 Stocker
👉 Utiliser une immunité spécifique contre les virus rencontrés

De quoi dépend la coupure de l’ADN par Cas ?

👉 De deux éléments :

1. La séquence cible (protospacer) complémentaire du crRNA

2. La présence d’un motif PAM adjacent dont la nature varie selon le type de Cas

Que se passe-t-il lorsque ces deux conditions sont réunies ?

👉 Le complexe Cas se fixe à l’ADN cible
👉 Les domaines endonucléases induisent une
👉 double cassure de l’ADN

Quel complexe peut être remplacé par un sgRNA ?

👉 Le complexe crRNA : tracrRNA (assure la stabilité et l’activation de Cas9)

Que contient un sgRNA ?

👉 Les deux séquences crRNA et tracrRNA
👉 Un court lien assurant la bonne conformation

Quelle avancée a permis l’utilisation du sgRNA ?

👉 La création des premiers modèles murins CRISPR/Cas9

Où peut être réalisée l’édition génomique avec CRISPR/Cas9 ?

👉 Directement dans les zygotes
👉 Sans passer par les cellules souches embryonnaires

Quel est l’impact de CRISPR/Cas9 sur les modèles in vivo ?

👉 Accélération majeure de la génération de modèles in vivo

Quels sont les deux grands types de mutations générées ?

• Petites insertions ou délétions (indels)

• Modifications précises via HDR

Comment sont produites les insertions/délétions ?

👉 Par réparation des cassures double brin via le NHEJ

Quelles sont les conséquences du NHEJ ?

👉 Décalage du cadre de lecture
👉 Codon stop prématuré
👉 Dégradation de l’ARNm par NMD

Comment sont obtenues les modifications précises ?

👉 Via un ADN donneur
👉 Par la réparation HDR

Quelle est la limite du mécanisme HDR ?

👉 Faible efficacité
👉 Fréquence de succès réduite

De quoi dépend la réussite de l’édition génomique ?

Du mode d’administration du CRISPR/Cas 9.

Sous quelles formes Cas et l’ARN guide peuvent-ils être délivrés ?

• ADN plasmidique

• ARN

• Complexe ribonucléotidiques (RNP)

À quoi sert CRISPR/Cas pour les souris humanisées ?

• Remplacer des gènes murins

• Par leurs orthologues humains

Que peut-on modifier avec CRISPR ?

• Des loci génomiques spécifiques

• Des élements régulateurs en dehors des régions codantes

Que permet cette stratégie chez la souris ?

Expression d’ARN et de protéines humaines

Quels outils permettent un knock-down génique ?

• SiRNA

• shRNA

• ARN anti-sens

• Oligonucléotides anti-sens

Quels types d’oligonucléotides sont utilisés ?

👉 Morpholino (chez le zebrafish)
👉 Gapmère chez la souris

Que sont les LNA GapmeRs ?

👉 Oligonucléotides antisens modifiés

Quelle est leur cible ?

👉 ARNm ou lncRNA

Quelle est leur structure ?

👉 Extrémités en LNA (locked nucleic acid)
👉 Cœur en ADN

Quel est le rôle des extrémités LNA ?

👉 Rigidifier la structure
👉 Augmenter fortement l’affinité pour l’ARN cible

Comment est dégradé l’ARN cible ?

👉 RNase H reconnaît l’hybride ADN–ARN
👉 Clivage de l’ARN
👉 Knock-down efficace du gène

Qu’est-ce qu’un knock-in constitutif ?

👉 Expression d’un gène d’intérêt
👉 Sous le contrôle des éléments régulateurs endogènes

Quelle stratégie est utilisée dans l’exemple décrit ?

👉 Insertion d’un cDNA humain
👉 Suivi de l’UTR 3’ murine
👉 Et d’un signal de polyadénylation

Où est inséré le cDNA humain ?

👉 Dans le premier exon codant du gène murin

Quel est l’effet de cette stratégie ?

👉 Expression de la protéine humaine
👉 Selon la régulation naturelle murine
👉 Suppression de la protéine murine