Tema 2

¿Qué es el genoma, y qué otros elementos en la jerarquía de la información hay?

El genoma se define como el conjunto completo de material genético (ADN) de una célula u organismo, que en eucariotas incluye el ADN cromosómico, mitocondrial y, en plantas, el cloroplastidial. Las fuentes establecen una jerarquía de información conocida como datos "ómicos":

• Transcriptoma: Es la colección de todos los transcritos de genes (ARN) presentes en una célula o tejido en un momento dado. A diferencia del genoma, que es estático, el transcriptoma es variable en el espacio y el tiempo según el tipo celular y sus condiciones.

• Proteoma: El conjunto de todas las proteínas presentes en un momento determinado.

• Metaboloma: El conjunto completo de metabolitos orgánicos producidos por las reacciones metabólicas de la célula.

El flujo de información sigue la secuencia:

ADN (Genoma) → Transcripción → ARN (Transcriptoma) → Traducción → Proteína (Proteoma) → Metabolitos (Metaboloma)

Tipos de estrategias de secuenciación de genomas completos

• Secuenciación Shotgun ("Escopeta"): Consiste en romper el ADN genómico en fragmentos pequeños y aleatorios, y hacer muchas copias de estos fragmentos para que se solapen entre sí. Cada fragmento se secuencia y luego potentes programas informáticos utilizan los solapamientos para ensamblar la secuencia completa.

• Secuenciación Shotgun Jerárquica (Clone-by-clone): Utilizada en proyectos de gran escala, primero se fragmenta el genoma en segmentos grandes (clonados en vectores BAC o YAC, porque otros no son capaces de almacenar fragmentos tan grandes) y se ordenan a través de herramientas como el solapamiento o FISH. Posteriormente, cada uno de estos segmentos grandes se fragmenta en piezas más pequeñas para su secuenciación, ordenamiento y ensamblaje en tramos continuos llamados contigs (que son el fragmento grande pero ordenado).

• Paseo Cromosómico (Chromosome Walking): Es un método de secuenciación lineal en el que se va enlazando un fragmento conocido del genoma con otro, gracias a una sonda complementaria del extremo del fragmento inicial (en el fragmento inicial partimos de una parte conocida y dejamos que se extienda un poco más en una parte desconocida. Hacemos la sonda de la parte desconocida y vemos con qué fragmento clonado se une). Aunque es muy preciso, resulta lento y laborioso.

Menciona los tipos más importantes de tecnologías de secuenciación

Nueva Generación (NGS) o Secuenciación Masiva: Estas técnicas permiten determinar la secuencia de millones de fragmentos simultáneamente.

• Illumina: Es un método barato y preciso, aunque se ve limitado por lo cortas que son sus lecturas (en cuanto a la longitud de los fragmentos que analiza).

  • Preparación de librerías: El ADN genómico se fragmenta y se le añaden adaptadores en los extremos, que son secuencias conocidas que permiten que los fragmentos se unan a una matriz sólida.

  • Amplificación en puente (Bridge Amplification): Una vez unidos a la superficie, cada fragmento se replica múltiples veces para formar grupos de copias idénticas llamados clusters. Esto es necesario porque la señal fluorescente de una sola molécula sería demasiado débil para ser detectada.

  • Secuenciación por síntesis: Se añaden nucleótidos marcados con fluorescencia y terminadores reversibles. En cada ciclo, se incorpora un tipo de nucleótido, se excita con un láser y una cámara fotografía la matriz para registrar el color emitido. Posteriormente, se elimina la marca fluorescente y el terminador para permitir el siguiente ciclo.

  • Análisis de datos: El secuenciador reconstruye la secuencia completa analizando la serie de imágenes capturadas.

Tercera Generación (Lecturas Largas): Superan la limitación de las lecturas cortas, facilitando el ensamblaje de regiones complejas.

• PacBio SMRT: Permite obtener lecturas largas y secuenciar simultáneamente cientos de miles de moléculas en tiempo real. Esta técnica utiliza un microchip con pocillos individuales, en cuyo fondo se fija la polimerasa que incorpora los nucleótidos.

  • Ligado de adaptadores (bucle en horquilla): Se fragmenta el ADN en fragmentos largos y se añaden adaptadores que forman una estructura conocida como bucle en horquilla de cadena sencilla.

  • Polimerasa fijada en el fondo de cada ZMW: La polimerasa se coloca en el fondo del pocillo para capturar el fragmento de ADN circularizado.

  • Incorporación de nucleótidos marcados: La polimerasa añade nucleótidos que están marcados con fluoróforos, y los nucleótidos que no forman parte del bucle se desnaturalizan.

  • Detección de fluorescencia en tiempo real: Un detector de imágenes registra la emisión de fluorescencia de cada nucleótido conforme se incorpora, generando la secuencia en tiempo real.

Como el ADN se presenta en forma circular, la misma secuencia puede secuenciarse varias veces, lo que reduce los errores de secuenciación y permite obtener lecturas más precisas.

• Oxford Nanopore: El método se basa en un nanoporo, un poro extremadamente pequeño, por el que pasa una molécula de ADN de cadena simple a la vez. A diferencia de otras técnicas, las bases nitrogenadas no están marcadas con fluorescencia. Conforme la molécula de ADN atraviesa el nanoporo, cada una de las cuatro bases produce alteraciones eléctricas distintas, generando un patrón de picos que permite determinar la secuencia. El método genera errores de lectura debido a que las diferencias eléctricas entre bases son muy sutiles. Sin embargo, su principal ventaja es que permite secuenciar prácticamente cromosomas completos en una sola corrida, gracias a la longitud de las lecturas.

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