BATTERIOLOGIA GENERALE PAG 1-32

La cellula batterica - dimensioni, forma e raggruppamento

La cellula batterica è una cellula procariotica di piccole dimensioni

Diametro → da frazioni di micrometro a pochi micrometri

Forma:

• Sfera (cocchi)

  • se sono riuniti a due a due vengono chiamati diplococchi

  • se sono riuniti a grappolo vengono chiamati stafilococchi

  • se sono riuniti a catenelle vengono chiamati streptococchi

• Cilindro (bacilli)

  • se sono particolarmente corti vengono chiamati coccobacilli

  • se presentano estremità assottigliate vengono detti bacilli fusiformi

  • se presentano curvature lungo l’asse maggiore, vengono definiti vibrioni o spirilli

  • come raggruppamenti principali abbiamo i diplobacilli e streptobacilli

La cellula batterica - composizione chimica

La componente più abbondante è l’acqua (fino all’80%):

• E’ il solvente in cui sono disciolti i vari componenti organici e inorganici della cellula

• Costituisce il mezzo in cui queste sostanze possono muoversi e interagire

Componenti inorganici più importanti:

• Potassio, sodio

• Calcio, magnesio

• Ferro, zinco

• Fosforo, zolfo

Sono inoltre presenti varie sostanze organiche a basso peso molecolare:

• I componenti più complessi di una cellula batterica sono le macromolecole o polimeri costituiti da composti organici a basso peso molecolare (polimeri)

Colorazione di Gram

Distinguiamo:

• Colorazioni Semplici:

  • Si eseguono mettendo a contatto, in un solo tempo, un unico colorante con il preparato contente i batteri da osservare

  • Hanno lo scopo di evidenziare la morfologia della cellula batterica

  • I coloranti più usati sono il Cristalvioletto, Fucsina Basica, Blu Di Metilene

• Colorazioni Differenziali:

  • Prevedono l’utilizzo di più coloranti applicati in tempi successivi

  • Permettono di evidenziare differenze di colorazione tra specie batteriche diverse

Colorazione di Gram:

• E’ il metodo di colorazione differenziale più importante

• Prevede 4 passaggi:

  • 1. Il preparato contenente batteri viene trattato con una soluzione di cristalvioletto per 2-3 minuti

  • 2. Il colorante viene eliminato e si mordenza (fissa) la colorazione tramite soluzione di iodio e ioduro di potassio in acqua, detto liquido di Lugol (per un minuto)

    • i mordenti sono sostanze che formano composti insolubili con un colorante, rendendo più stabile la sua adesione al substrato

  • 3. Si applica un decolorante sul preparato per 1-2 minuti (alcol etilico o acetone)

  • 4. Si applica un secondo colorante per 1-2 minuti (fucsina o safranina, di colore rosso, facilmente distinguibile dal violetto del primo colorante)

• Risultato:

  • Al termine della colorazione, i batteri che appaiono violetti sono detti Gram-Positivi

  • Quelli che appaiono rossi sono detti Gram-Negativi

• Queste differenza di colorazione dipende dalla permeabilità degli involucri cellulari:

  • Nei Gram-Positivi il complesso cristalvioletto-iodio che si forma all’interno della cellula dopo il trattamento con Lugol non riesce ad attraversare la parete cellulare neanche dopo aver applicato alcol etilico o acetone

  • Nei Gram-Negativi invece i decoloranti riescono ad esportare il complesso cristalvioletto-iodio, permettendo così al secondo colorante di colorare la cellulare

  • Questo significa che i batteri Gram-Positivi hanno maggiore spessore della parete cellulare che dà come risultato una minore permeabilità degli involucri nucleari

Architettura della Cellula Procariotica

Architettura essenziale:

• Dimensioni ridotte e assenza di compartimenti intracellulari separati da membrane

• Struttura cromosomica semplice immersa direttamente nel citoplasma, senza membrana nucleare

• Citoplasma delimitato dalla membrana citoplasmatica dalla quale si diramano verso l’interno delle invalidazioni che formano il sistema dei mesosomi

  • I mesosomi sono coinvolti nei processi di divisione cellulare, secrezione di esoenzimi e nei processi di fosforilazione ossidativa

  • I mesosomi sono più frequenti nei Gram-positivi

• Tutta la struttura è racchiusa dalla parete cellulare (o sacculo), che sulla superficie presenta una capsula di natura polisaccaridica

• In alcune specie abbiamo appendici libere:

  • Flagelli, importanti per la locomozione

  • Pili, importanti per la coniugazione

Il cromosoma batterico (nucleoide)

Nella cellula batterica materiale cromosomico è immerso direttamente nel citoplasma, senza membrana nucleare, questo lo chiamiamo Nucleoide:

• Il nucleoide può essere considerato l’equivalente di un cromosoma, detto infatti cromosoma batterico o cromonema

  • Spesso un batterio può presentare più di una copia del cromosoma, ciò è dovuto alla mancanza di simultaneità tra la replicazione del materiale cromosomico e la divisione cellulare (nei batteri replicazione e divisione cellulare non sono sincrone, se la cellula inizia una nuova replicazione prima di dividersi, possono esserci più copie del cromosoma nella stessa cellula, questo è tipico in batteri a crescita rapida come l'Escherichia Coli)

• Il DNA batterico appare come unico lungo filamento senza estremi liberi, quindi è circolare (ad eccetto di alcune Spirochete che hanno genoma lineare)

• A differenza del DNA eucariotico, quello batterico non è legato agli istoni, ma complessato a proteine acidiche dalle quali può dissociarsi facilmente

• Il cromosoma batterico è collegato alla membrana plasmatica in punti specifici

• Oltre al cromosoma abbiamo molecole di DNA circolare più piccole chiamate Plasmidi, che hanno autonomia replicativi e possono condizionare gli aspetti fenotipici del batterio

Nel citoplasma batterico e i ribosomi batterici

Nel citoplasma batterico possono esserci accumuli di sostanze con funzione di riserva, costituiti da:

• Glicogeno

• Polimeri dell’acido beta-idrossibutirrico

• Polisaccaridi

• Polifosfati

  • Questi si colorano in rosso con il blu di toluidina (metacromasia) e vengono indicati come granuli metacromatici

Poi sono presenti anche i ribosomi:

• Fondamentali per la sintesi proteica

• I ribosomi procariotici presenta delle differenze rispetto quelli eucariotici che sono alla base della selettività di alcuni farmaci antibatterici che hanno come bersaglio proprio i ribosomi

• I ribosomi batterici sono costituiti da:

  • RNA (60%) e Proteine (40%)

  • Due sub-unità, quella minore formata da 21 proteine e una molecola di RNA 16S, e quella maggiore formata da 34 proteine e due tipi di RNA, 5S e 23S

• (nelle cellule eucariotiche i ribosomi sono associati alla membrana del RE, in quelle procariotiche no perché il RE manca)

La membrana citoplasmatica batterica

Come la eucariotica è formata da lipidi, proteine e piccole quantità di carboidrati, ma differisce per:

• Composizione lipidica semplice:

  • Acidi grassi polinsaturi sono più rari

  • Acidi grassi ramificati e derivati dal ciclopropano sono più frequenti

• Gli steroli sono completamente assenti, ad eccezione dei MIcoplasmi (che sono privi di parete cellulare)

• Proteine di membrana:

  • Nelle eucariotiche sono per la maggior parte glicosilate, in quelle procariotiche no (ad eccetto di alcune Spirochete)

• La quota di carboidrati presente nella membrana batterica sono legati alla componente lipidica a formare glicolipidi e glicosfingolipidi

Funzioni membrana citoplasmatica batterica:

• Controllare gli scambi metabolici tra citoplasma e ambiente esterno, attraverso la diffusione passiva e trasporto attivo

• E’ sede di processi biosintetici come la sintesi del peptidoglicano

• Nei batteri che producono ATP con la respirazione, è sede di enzimi e vettori della catena respiratoria e del processo di fosforilazione ossidativa (cosa che negli eucarioti avviene nei mitocondri)

Sacculo o Parete Cellulare

La cellula batterica è racchiusa da una struttura rigida chiamata sacculo o parete cellulare:

• Nei Gram positivi la superficie cellulare è costituita da:

  • membrana citoplasmatica

  • spesso strato peptidoglicano (spessore 200-800 angstrom)

• Nei Gram negativi la superficie cellulare è costituita da:

  • membrana citoplasmatica

  • sottile strato di peptigoglicano (spessore 20-30 angstrom)

  • membrana esterna

Il peptigoglicano è il principale componente della parete cellulare:

• E’ un grande polimero formato dalla ripetizione di un’unità formata da due carboidrati azotati:

  • N-acetilglucosamina

  • Acido muramici

• Legate tra loro mediante legami beta-1,4 glicosidici a formare catene lineari

• Poi questi polimeri lineari sono collegati trasversalmente attraverso:

  • un tetrapeptide costituito da L-alanina, acido D-glutammico, L-lisina, D-alanina

  • o mediante un ponte pentaglicinico (5 molecole di glicina) come negli Sfatilococchi

Parete cellulare dei batteri Gram Positivi

Costituito dalla membrana citoplasmatica e parete cellulare sovrastante formata da spesso strato di peptigoglicano e altri polimeri:

• Tra gli altri polimeri, principalmente abbiamo gli Acidi Teicoici, che sono polimeri di alcoli polivalenti (generalmente glicerolo o ribitolo) esterificati con acido fosforico

  • questi presentano una notevole variabilità di composizione, contribuendo in modo significativo alla specificità antigenica dei singoli batteri

  • alcuni si legano alla porzione lipidica (acidi lipoteicoici) e sembrano essere importanti per ancorare la parete cellulare alla membrana citoplasmatica sottostante

• La parete cellulare dei Gram Positivi è altamente polare, quindi si oppone al passaggio di molecole idrofobiche, mentre è permeabile alle molecole idrofile

  • a causa di questa polarità, lega grandi quantità di cationi che creano un ambiente ionico adatto al funzionamento degli enzimi presenti nella membrana citoplasmatica (in particolare quelli coinvolti nella sintesi del peptigoglicano, che richiedono ioni magnesio)

  • questa capacità di legare grandi quantità di cationi è dovuta alla tolleranza dei gram positivi a concentrazioni saline elevate, caratteristica sfruttata per preparare terreni di coltura selettivi (aggiungendo sali biliari o NaCl) per favorire la crescita dei gram positivi.

Parete cellulare dei Gram Negativi

Nei gram negativi la parete cellulare è formata esclusivamente da un sottile strato di peptigoglicano:

• La parete cellulare non è in grado di contrastare il passaggio di molecole idrofobiche, che potrebbero danneggiare la membrana citoplasmatica

• Per questo motivo, abbiamo una seconda membrana cellulare, la membrana esterna, situata al di sopra dello strato di peptigoglicano

• La membrana esterna ha struttura bilaminare con organizzazione asimmetrica:

  • Foglietto interno formato da fosfolipidi

  • Foglietto esterno contenente il lipopolisaccaride batterico (LPS) coinvolto nell’azione patogena dei gram negativi

Il liposaccaride batterico è costituito da:

• porzione lipidica, chiamata lipide A, che rappresenta l’endotossina vera a propria

• porzione polisaccaridica, formata a sua volta da:

  • una prima parte che costituisce il core della molecola → struttura costante, corta catena di zuccheri che comprendono l’acido chetodeossioctonoico e un eptoso

  • la seconda parte è una lunga catena polisaccaridica con proprietà antigeniche (antigene O) → caratterizzata da ripetizioni di subunità tri-tetra o penta-saccaridiche.
    Le diverse catene polisaccaridiche sono in grado di legare cationi bivalenti come il magnesio, e fungono da ponte tra le varie catena conferendo compattezza

A causa della sua natura lipidica, la membrana esterna ostacola il passaggio oltre che alle molecole idrofobiche, anche a quelle idrofile:

• Per questo motivo, abbiamo le porine (proteine) che nello spesso della membrana esterna formano canali e permettono la diffusione passiva di molecole idrofile come zuccheri, amminoacidi e alcuni ioni (con peso molecolare inferiore a circa 600-700 Dalton)

La membrana esterna è collegata alla parete cellulare sottostante tramite:

• Lipoproteine con legami covalenti con lo strato di peptigoglicano

• Porine con legami non covalenti con lo strato di peptigoglicano

Periplasma e Capsula

Periplasma:

• Indica lo spazio tra membrana esterna e membrana citoplasmatica di un batterio gram negativo

• Questo spazio contiene lo strato di peptigoglicano e proteine

• Tra queste proteine abbiamo:

  • Proteine capaci di legare molecole idrofile

  • Enzimi con funzione digestiva (proteasi, nucleari, fosfatasi)

  • Enzimi detossificanti (in grado di inattivare farmaci antibatterici)

Capsula:

• Involucro mucoso che può essere su molti batteri sia gram positivi che negativi

• Mucoso per materiali viscosi formati generalmente da polisaccaridi che rimangono aderenti alla superficie della cellula

  • eccezione fatta dal batterio bacillus anthracis, cui materiale è un peptide omopolimerico formato da polimeri di D-glutammato

• Funzioni della capsula:

  • Conferisce al batterio proprietà di adesione (ad esempio lo Streptococcus mutans per aderire alla superficie dei denti)

  • Presenta proprietà antifagocitarie (come i meningiococchi, con uno spesso strato capillare che raggiungere gli organi bersaglio), cioè rende invisibile il batterio al sistema immunitario

  • E’ componente essenziale per formare il biofilm, che favorisce la persistenza per processo infettivo

I flagelli, il movimento della cellula batterica

I batteri osservati al microscopio in un liquido isotonico presentano un movimento oscillatorio:

• Non dovuto alla sua motilità attiva, né alla sua vitalità

• Si tratta di un movimento browniano

  • è un movimento casuale dovuto all'urto costante con le molecole del fluido

Invece i batteri che presentano i flagelli (generalmente i bacilli, vibrioni e spirilli, quindi forma cilindrica):

• Sono strutture elicoidali che determinano movimento attivo attraverso la loro rotazione a livello del corpo basale

• A differenza di quelli eucariotici, sono rigidi e presentano movimenti ondulatori

• Distinguiamo:

  • Flagelli polari → quando presenti a uno o entrambi i poli della cellula (monotrichi se è presente solo un flagello, lofotrichi se è presente un ciuffo di flagelli)

  • Flagelli peritrichi → quando distribuiti sulla superficie cellulare

Un singolo flagello presenta tre parti principali:

• Lungo filamento elicoidale che sporge dalla superficie cellulare per circa 5-10 micrometri:

  • E’ costituito da sub-unità proteiche di flagellina con proprietà antigeniche (antigene H) che si assemblano formando una struttura elicoidale

• Gancio → struttura tubolare che collega il filamento al corpo basale

  • E’ costituito da sub-unità proteiche costituite da una singola proteina che si aggregano

• Corpo basale → struttura che ancora il flagello agli involucri cellulari e rappresenta il motore del movimento rotatorio del flagello

  • Costituito da almeno 15 tipi diversi di sub-unità proteiche che si organizzano diversamente nei batteri gram positivi e negativi

La parte prossimale del filamento è detta bastoncello ed è formata da alcune subunità proteiche:

• Nei gram negativi le subunità formano 4 anelli:

  • Anello L → in corrispondenza del lipopolissacaride della membrana esterna

  • Anello P → in corrispondenza del peptigoglicano della parete cellulare

  • Anello S → sopra la membrana citoplasmatica

  • Anello M → in corrispondenza della membrana citoplasmatica

• Nei gram positivi abbiamo solo:

  • Anello P e M

I flagelli sono strutture elicoidali avvolte in senso sinistroso:

• La rotazione antioraria produce una propulsione monodirezionale della cellula (swimming)

• La rotazione oraria produce un movimento disordinato avanti e indietro (tumbling)

• La rotazione dei flagelli dipende da chemiorecettori di superficie che rispondono a stimoli attraenti o repellenti, e in base a ciò generano swimming o tumbling

Fimbrie e Pili

Fimbrie:

• Originano dalla membrana citoplasmatica e protrudono dalla superficie cellulare per 0,2-2 micrometri

• Sono formate da subunità costituite da una o due proteine chiamate Piline (specifiche per specie batteriche) che si organizzano a formare una struttura elicoidale, cilindrica e rigida

• All’estremità libera presentano Adesine che conferisce proprietà adesiva verso substrati

  • in particolare verso carboidrati di glicoproteine di membrana di varie cellule animali

  • ma anche verso carboidrati presenti nelle proteine di membrana di globuli rossi (capacità emoagglutinante)

• Classificabili in base ai carboidrati recettoriali che inibiscono la loro capacità adesiva:

  • Fimbrie di tipo 1 → adesione inibita dal mannosio

  • Tipo 2 → inibita dalla N-acetil-galattosammina

  • Tipo P → inibita da un dimero del galattosio

• In alcuni enterobatteri (come escherichia coli e salmonella), abbiamo varianti delle fimbrie chiamate Curli:

  • più sottili e costituite da Curlina (proteina amiloide)

  • permettono al batterio di aderire a proteine come plasminogeno, fibronectina e proteine dell’MHC I

  • questa proteina è tossica e contribuisce alla sintomatologia morbosa

• Un’altra classe di fimbrie è rappresentata dai Pili F (che sta per fertilità) o pili sessuali:

  • sono più lunghi e coinvolti nei processo di coniugazione batterica

Metabolismo Batterico - aerobiosi e anaerobiosi

Autotrofi ed eterotrofi

I batteri svolgono processi catabolici per produrre ATP che viene usata nelle reazioni biosintetiche (anaboliche) responsabili della crescita batterica.

In base ad esigenze metaboliche:

• Aerobi Obbligati → vivono solo in presenza di ossigeno, quindi respirazione aerobia dove l’ossigeno è l’accettore finale degli ioni idrogeno che viene ridotto ad acqua

• Aerobi o Anaerobi Facoltativi → vivono sia in presenza che in assenza di ossigeno. Quando in assenza, l’accettiore finale di ioni idrogeno è il nitrato, che viene ridotto a nitrito

• Anaerobi Obbligati → vivono solo in assenza di ossigeno, quindi respirazione anaerobia o fermentativa (i batteri quindi muoiono in presenza di ossigeno)

• Microaerofili → sono batteri crescono molto lentamente (o non crescono) in presenza di ossigeno, mentre crescono molto bene in assenza di ossigeno (o in aria con il 10% di anidride carbonica)

Autotrofi ed eterotrofi:

• Autotrofi → sintetizzano costituenti usando sostanze inorganiche semplici

  • sono fotosintetici se usano luce solare

  • sono chemiosintetisi se usano composti inorganici (anche in assenza di luce)

• Eterotrofi → possono metabolizzare composti già sintetizzati da altri organismi

  • sono saprofiti se ottengono cibo dalla materia vegetale e animale in via di decomposizione

  • sono parassiti se usano il metabolismo di altri animali per procurarsi cibo senza per forza recare danno

Metabolismo Batterico - Sintesi del Peptidoglicano

1:

• Nel citoplasma, una molecola di N-acetilglucosammina-fosfato (NAG-P) si lega a Uridina-trifosfato (UTP) con liberazione di due gruppi fosfati

• Si forma Uridina-difosfato-N-acetilglucosammina (UDP-NAG)

2:

• UDP-NAG si lega con una molecola di Fosfoenolpiruvato

• Si forma Uridina-difosfato-N-acetilglucosammina-piruvato (UDP-NAG-piruvato)

• Reazione che può essere inibita dall’antibiotico fosfomicina, analogo del fosfoenolpiruvato

3:

• Il piruvato viene ridotto ad acido lattico

• Si forma Acido Muramico (NAM) che rimane legato a UDP-NAM

4:

• All’acido muramico si legano alcuni amminoacidi, nell’ordine:

  • L-alanina

  • Acido D-glutammico

  • L-lisina (o acido meso-diaminopilemico)

  • Dimmelo di D-alanina (prodotto tramite racemasi che trasforma L in D-alanina, poi una sintetasi forma il dimero → reazione inibita all’antibiotico cicloserina, analogo della d-alanina)

• Si forma Uridina-difosfato-N-acetilglucosammina-pentapeptide (UDP-NAM-pentapeptide)

5:

• Dalla molecola di UDP-NAM-pentapeptide viene rimosso UDP

• Si forma N-acetilglucosammina-pentapeptide (NAM-pentapeptide) che si lega all’undecaprenil-fosfato (vettore lipidico della membrana citoplasmatica)

• Contemporaneamente un gruppo fosfato dell’UDP rimosso viene trasferito al vettore lipidico e si forma: Uridina-monofosfato (UMP) e undecaprenil-difosfato

6:

• Nella membrana citoplasmatica, al NAM-pentapeptide legato al vettore lipidico si aggiunge una molecola di N-acetilglucosammina proveniente da UDP-NAG con liberazione di UDP

• Si forma così Undecaprenil-difosfato-NAG-NAM-pentapeptide (undecaprenil-difosfato-N-acetilglucosammina-N-acetilmuramico-pentapeptide)

• Quest’ultima rappresenta l’unità basale completa di peptigoglicano

7:

• Queste unità basali si polimerizzano tramite legami glicosidici beta 1-4

• E poi i polimeri si legano trasversalmente tramite legami peptidici tra i pentapeptidi di catene adiacenti

• Reazioni catalizzate da PBP 1A e 1B che fungono sia da transglicosilasi che transpeptidasi

8:

• Alla fine i polimeri vengono liberati dal vettore lipidico (reazione inibita dagli antibiotici vancomicina e ristocetina) e trasferiti all’esterno della membrana citoplasmatica

• Qui viene rimossa una molecola di D-alanina dal pentapeptide, cui energia liberata viene usata per inserire i nuovi frammenti di peptidoglicano nei siti di allungamento della parete

  • Inserimento catalizzato da PBP 2 e 3, nei punti di accrescimento dove il peptigoglicano vecchio è stato tagliato da PBP 4

• Le reazioni catalizzate da proteine PBP sono inibite da penicillina e cefalosporine che sono antibiotici beta lattamici

9:

• Il vettore lipidico liberato (undecaprenil-difosfato) viene defosforilato (reazione inibita dalla bacitracina) e riciclato

Azione battericida degli antibiotici

L’effetto battericida non dipende dal fatto che gli antibiotici bloccano la sintesi del peptidoglicano, ma dall’attivazione di enzimi autolitici (autolisine):

• Questi enzimi formano una breccia nella parete cellulare, e siccome la sintesi del peptidoglicano è bloccata, si forma una breccia nella parete cellulare che porta alla lisi osmotica del batterio

• Alcuni batteri come lo Streptococcus pneumoniae, può mutare e rendere inefficace l’attivazione di autolisine

  • Si osserva così tolleranza agli antibiotici che bloccano la sintesi del peptidoglicano

  • In questo caso non abbiamo azione battericida, ma il blocco della sintesi del peptidoglicano determina l’arresto della crescita e divisione cellulare batterica

Riproduzione Batterica

I batteri si riproducono per scissione binaria, prrocesso dove una cellula batterica si divide in due cellule figlie identiche alla madre, le fasi sono:

• Dopo la duplicazione del cromonema (cromosoma batterico), le due molecole di DNA circolare risultanti si fissano in due punti differenti della membrana citoplasmatica

• Successivamente accresce la regione di membrana interposta tra le due strutture cromosomiche che quindi si allontano tra loro

• La membrana citoplasmatica si introflette al centro della cellula batterica allungata e si forma un setto

• A setto completamente formato, avremo due pareti cellulari distinte → separazione della cellula batterica nelle due cellule figlie

Le Spore

Ultrastruttura della Spora

E’ una caratteristica di alcuni bacilli dei generi Bacillus e Clostridium:

• Nei preparati colorati la spora appara come un piccolo corpo incolore all’interno del batterio, poiché è difficilmente penetrabile dai coloranti

• Si osserva al microscopio ottico

• Nei batteri di genere Bacillus il diametro della spora non supera quello della cellula batterica (o sporangio), nei batteri di genere Clostridium invece si e quindi appara ingrossato in corrispondenza della spora

Ultrastruttura della Spora (dall’interno verso l’esterno):

• All’interno della spora abbiamo il citoplasma circondato dalla membrana plasmatica, cui faccia interna è aderente al materiale nucleare, mentre la faccia esterna è aderente ad una parete cellulare rudimentale costituita da peptidoglicano

• Esternamente alla parete cellulare poi abbiamo la Corteccia, formata principalmente da peptidoglicano e residui citoplasmatici dello sporangio

• Poi abbiamo un rivestimento interno ed esterno proteico (coats), ricco di ponti disolfuro e piccole quantità di lipidi e peptidoglicano

• Infine abbiamo l’Esosporio, sottile membrana fosfolipoproteica che contiene anche acidi teicoici, acido diaminopimelico e glucosamina

• Componente caratteristico della spora è l’acido dipicolinico, un acido carbossilico localizzato insieme a grandi quantità di calcio nella corteccia

Funzione della Spora

Caratteristiche che la distinguono dalla cellula vegetativa (forma attiva del batterio):

• Attività enzimatica e consumo di ossigeno molto ridotto

• Assenza di sintesi macromolecolari

• Estremamente resistente alla penetrazione di sostanze estranee (come i coloranti) a causa dei suoi spessi involucri esterni

• Più resistente all’essiccamento, radiazioni UV e gamma

• Notevole termoresistenza grazie ai due coats e la corteccia

• Presenta antigeni esclusivi della spora.

La Sporificazione

La Sporificazione:

• Divisione del materiale nucleare

• Uno dei nuclei risultati migra verso un polo della cellula e viene separato dal resto della cellula da un setto di membrana citoplasmatica → questa prima struttura la chiamiamo Prespora

• A partire dalla prespora inizia la deposizione delle diverse membrana che formano la spora vera e propria, che completa dei suoi involucri, verrà liberata nell’ambiente esterno tramite degradazione dello sporangio

• Tutto il processo dura dalle 6 alle 10 ore

• Nei batteri sporigeni non è obbligatorio che si formi la spora, il batterio può essere mantenuto in fase vegetativa o essere indotto a formare la spora generalmente quando:

  • Si ha un progressivo esaurimento delle sostanze nutritive

  • Accumulo di cataboliti che rallentano la moltiplicazione batterica

  • Durante la fase di crescita, la produzione di spore non avviene

  • Con la sporificazione, si ha la modificazione del fattore sigma dell’RNA polimerasi → questo rende l’enzima incapace di trascrivere geni necessari alla vita vegetativa, e capace di trascrivere solo quelli coinvolti nella sporificazione

• Durante la formazione della spora si ha l’espulsione di oltre il 98% di acqua

La Germinazione della spora

E’ il processo inverso, cioè da una spora si forma una nuova cellula vegetativa:

• Avviene solo in condizioni favorevoli, in particolare quando sono disponibili sostanze nutritive

• Spesso necessaria una fase di attivazione:

  • in laboratorio esponendo la spora a 65-80°C per alcuni minuti

  • in natura con l’invecchiamento della spora

• Questa attivazione consiste in un danno che aumenta la permeabilità degli involucri della spora, che permette l’avvio degli scambi metabolici con l’ambiente

• Tutto il processo dura circa 1-2 ore

• Fasi:

  • Formazione di una parete cellulare completa, seguita dalla fuoriuscita della cellula vegetativa dagli involucri alterati

  • Si avrà l’eliminazione dell’acido dipicolinico e rilascio di grandi quantità di calcio

  • Ricompare la termosensibilità e sintesi macromolecolare

• La cellula vegetativa neoformata può riprendere il ciclo di sporificazione o entrare in fase logaritmica di crescita

Come avviene l’eliminazione di una spora?

Con il processo di Tindalizzazione o Sterilizzazione frazionata:

• Riscaldare il materiale a 100°C per 30 minuti

• Incubare a temperatura ambiente per 24 ore

• Riscaldare nuovamente a 100°C per 30 minuti

• Incubare altre 24 ore

• Riscaldare per l’ultima volta

L’incubazione serve per far germinare le spore, poi le cellule vegetative vengono distrutte con il riscaldamento.

Importanza della metilazione

(dalle sbobine)

La metilazione è una modifica chimica che consiste nell’aggiunta di un gruppo metile a una base del DNA o RNA

• Questa modifica regola l’espressione di geni, cioè decide se un gene deve essere più o meno attivo

• Negli eucarioti la metilazione interessa la citosina, mentre nei procarioti interessa l’adenina in posizione 6

Negli eucarioti:

• La metilazione favorisce una maggior compattazione della cromatina, in associazione con gli istoni nel nucleosoma

• Quando il DNA è più compatto, i geni sono meno espressi

Dal punto di vista medico:

• La metilazione può influenzare patologia, incluse le infezioni virali

• Ad esempio, il virus dell’Epatite C è un virus a RNA a filamento positivo, il quale è molto rapido, poiché il suo RNA è simile a un mRNA pronto per essere tradotto

  • Questo significa che entrano nella cellula si dirigono subito ai ribosomi per produrre proteine virali

• Invece i virus a DNA per replicarsi deve raggiungere il nucleo della cellula ospite, mentre per quelli a RNA è sufficiente raggiungere il citoplasma

L’Operone:

• Un altro sistema di regolazione genetica nei batteri è dato dall’operone

• E’ un sistema dove più geni consecutivi sono controllati da un unico promotore

• In questo modo una cellula può attivare o silenziare più geni

Ribosomi

(dalle sbobine)

Sono coinvolti nella sintesi delle proteine, quelli procariotici e eucariotici differiscono per caratteristiche fisiche, misurate tramite il coefficiente di sedimentazione di Svedberg:

• Ribosomi Procariotici → 70S composto da due sub-unità

  • una maggiore 50S e una minore 30S

• Ribosomi Eucariotici → 80S composto da due sub-unità

  • una maggiore 60S e una minore 40S

Secrezione nei Procarioti - Pathways di secrezione proteica

I pathways di secrezione sec-dipendente (o pathway generale di secrezione):

• Si tratta di un sistema tipico dei batteri, in grado di mediare la traslazione delle proteine attraverso la membrana plasmatica o per l’integrazione in essa.

• Le proteine secrete vengono sintetizzate nel citosol come pre-proteine, che presentano un peptide segnale sull’N-terminale

• Subito dopo la sintesi, una chaperonina (Sec-B) si lega al peptide segnale per non far ripiegare la proteina

• A questo punto le proteine Sec-Y, Sec-E e Sec-G formano un canale transmembrana per far passare la pre-proteina

• In particolare Sec-A guida il passaggio della pre-proteina attraverso la membrana sfruttando l’idrolisi di ATP.

• Una volta attraversata la membrana, una peptidasi taglia il peptide segnale, così la proteina assume la sua conformazione finale

Un altro tipo è il Sistema Tat:

• Tat sta per twin arginine traslocation, cioè indica la presenza di due arginine consecutive nella sequenza segnale

• A differenza del sistema sec, le proteine trasportate sono completamente foldate

Pathway di secrezione di tipo II:

• E’ proprio dei batteri gram negativi, costituito da 12-16 proteine, la maggior parte delle quali sono proteine di membrana

• Trasporta dal periplasma alla membrana esterna le proteine traslocate dal sistema sec o tat (funziona come seconda porta)

Pathway di secrezione di tipo V:

• Anch’esso tipico dei gram negativi

• Detto anche sistema di autotrasporto perché una volta che le proteine vengono trasportate nel periplasma attraverso il sistema sec, formano un canale nella membrana esterna (con il loro dominio C-terminale) attraverso cui passano

• La proteina così passa, poi proteasi lasciano la C-terminale all’interno della membrana esterna

Pathway di secrezione di tipo I o ABC:

• Trasporta le proteine sia attraverso la membrana plasmatica che membrana esterna (forma un tunnel continuo)

• E’ presente sia nei gram positivi che negativi

• Si compone di un Trasportatore ABC inserito nella membrana plasmatica, che lega ATP e lo idrolizza per garantire il trasporto della proteina

• Poi abbiamo una proteina adattatrice detta MFP (membrana fusion proteine) che lega il trasportatore alla proteina TolC presente sulla membrana esterna

• Le molecole di questo sistema hanno grandezze variabili, generalmente è per tossine RTX e lipasi

Pathway di secrezione di tipo III:

• Tipico dei gram negativi

• Ha struttura a siringa che attraversa le due membrane e si inserisce sulla membrana della cellula ospite per rilasciare fattori di virulenza

Pathway di secrezione di tipo IV:

• Sia in gram positivi che negativi

• Responsabile della secrezione di proteine e DNA durante il processo di coniugazione batterica

Pathway di secrezione di tipo VI:

• Identificato cin Vibrio chlerae, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia Coli, Salmonella Typhimurium e Yersinia pestis.

• Sistema non del tutto chiaro

N.B.:

• Blebbing → fenomeno dei gram negativi che rilasciano vescicole di membrana contenenti fattori di virulenza

• I micobatteri presentano uno specifico pathway detto ESX-1 e consente alle proteine di attraversare gli spessi strati di arebinogalactani e di acidi micilici che caratterizzano l’involucro esterno dei micobatteri

Genetica Batterica - I Plasmidi

Il batterio non ha solo il cromosoma principale, ma anche i plasmidi che sono elementi genetici extra-cromosomici:

• I plasmidi sono piccole molecole di DNA circolare, bicatenario ed extra-cromosomico

• Molto più piccoli del cromonema: 1-200mila basi vs 1-5milioni di basi

• I plasmidi non sono essenziali per vivere, ma danno vantaggi, generalmente codificano per:

  • Tossine

  • Pili/adesine

  • Fattori R (danno resistenza a farmaci)

  • Batteriocine (uccidono altri batteri)

  • Siderofori (catturano ferro fondamentale per la crescita)

• Alcuni plasmidi sono detti coniugativi:

  • Permettono il contatto tra batteri, formando un ponte dove possono passare altri plasmidi o addirittura mobilizzare il cromonema

• Altri plasmidi sono detti episomi che possono replicarsi in modo autonomo o integrarsi nel cromosoma batterico e replicarsi con esso.

Trasformazione

La trasformazione è un modo con cui i batteri prendono DNA libero dall’ambiente e lo incorporano nel proprio genoma per acquisire nuove caratteristiche genetiche

L’esperimento di Griffith (1920):

• In una cavia viene inoculato:

  • batteri non capsulati vivi non virulenti

  • batteri capsulati virulenti, ma uccisi con il calore

• L’esito dell’esperimento porta alla morte della cavia per setticemia e i batteri isolati corrispondevano a batteri virulenti vivi

• Quello che è successo è che i batteri non capsulati sono stati trasformati in batteri capsulati a causa dell’assunzione di una sostanza trasformante ceduta dai batteri virulenti uccisi → questa sostanza è il DNA proveniente dai batteri uccisi

Il processo di trasformazione:

• La cellula accetrice deve trovarsi in uno stato di competenza

• Nei gram-positivi, una volta che la cellula diventa competente, libera il fattore di competenza (proteina) che interagisce con recettori presenti sulla cellula competente o cellule adiacenti, stimolando l’espressione di geni e conseguente produzione di proteine coinvolte nel processo di trasformazione

  • tra questa abbiamo l’autolisina che digerisce una porzione di parete cellulare ed espone un tratto di membrana dove si posizionano proteine in grado di legare DNA bicatenario e una specifica nucleasi

  • Queste proteine DNA-binding legano quindi il DNA presente nell’ambiente derivante dalla morte di un batterio donatore

  • Uno dei suoi filamenti viene digerito dalla nucleasi, mentre l’altro viene introdotto e integrato nel DNA cromosomico della cellula competente

• Nei tram-negativi invece il fattore di competenza non viene prodotta e quindi la trasformazione può avvenire solo in particolari condizioni del mezzo colturale

Trasduzione

La trasduzione è un trasferimento di DNA tra batteri mediato da un batteriofago:

• Un fago è un virus che infetta i batteri, presenta tipica forma a spillo con:

  • una testa contenente l’acido nucleico

  • una coda che inietta il DNA

  • fibre che riconoscono il batterio

• Il fago si lega al batterio, inietta il DNA e poi possiamo avere due possibilità:

  • Ciclo Litico → il fago si replica subito, produce tante copie che si liberano con la conseguente lisi della cellula ospite. Parliamo di fagi virulenti

  • Ciclo Lisogeno → il DNA del fago si integra nel batterio (si forma un profago). Il fago resta silente e si replica insieme al batterio, poi può attivarsi in seguito a certi stimoli e indurre un ciclo litico. Parliamo di fagi temperati.

• Durante questi processi, il fago può trasferire DNA batterico da un batterio all’altro, distinguiamo due tipi di trasduzione:

  • Trasduzione Generalizzata → avviene nel ciclo litico, dove durante la replicazione del fago viene erroneamente preso DNA batterico invece che DNA virale, si formano così particelle trasducenti che possono trasferire DNA batterico da un batterio all’altro

  • Trasduzione Specializzata → durante il ciclo lisogeno, il DNA virale a un certo punto si stacca da quello batterico, però erroneamente può portarsi via anche un pezzo di DNA batterico, così durante la replicazione porterà a particelle fagiche defettive che sono in grado di infettare e integrarsi nel genoma di altri batteri, ma non sono in grado di indurre lisi.

Conversione lisogenica

Nei batteri lisogeni il DNA del profago rimane generalmente silente, ma in alcuni casi una parte del genoma del profago viene espressa.

Quando questo succede si ha la codifica per prodotti che modificano il fenotipo del batterio.

E’ possibile che i geni del profago coinvolti nella conversione lisogenica derivino da geni batterici acquisiti in precedenza dal fago attraverso processi di ricombinazione genetica.

Questi prodotti non sono coinvolti nei processi replicativi del virus, non servono all’economia generale del fago e sono meno sensibili al controllo repressivo.

Coniugazione Batterica

Consiste nel diretto trasferimento di materiale genetico da un batterio a un altro, attraverso un contatto fisico tra le due cellule:

• Questo processo avviene per mezzo di Plasmidi Coniugativi, tra cui il plasmide F

Plasmide F:

• E’ una molecola di DNA circolare bicatenario, che si replica autonomamente

  • 1/3 del suo DNA è costituito da 13 geni “tra”, che codificano per un pilo F e proteine per la replicazione del DNA

• Presente in E.coli e altri enterobatteri

Quando una cellula contente il plasmide F (cellula F+, donatrice) incontra una che non lo ha (cellula F-, accettrice):

• Si formano coppie coniugali

• Il pilo F della cellula F+ si lega alla cellula F- e si stabilisce un ponte coniugativo

• Poi il DNA plasmidico viene tagliato al punto “oriT” (origine di trasferimento) e parte la replicazione tramite “Rolling Circle”

Replicazione Rolling Circle:

• In corrispondenza di un origine viene tagliata una catena del DNA circolare

• L’estremità 3’-OH della catena polinucleotidica tagliata funge da primer per la DNA polimera che sintetizza la nuova catena

• Mentre l’estremità 5’ si allontana man mano

• Poi quando la catena polinucleotidica nuova è stata completamente sintetizzata, la catena parentale si distacca e fungerà da stampo per la sintesi di una catena complementare, con la formazione di una seconda molecola di DNA a doppia elica che poi tenderà a ricircolarizzarsi

• Si ottengono così due plasmidi, la cellula F- diventa F+ e può produrre anch’esso pilo F e trasferire il plasmide ad altri batteri.

Come avviene il trasferimento del materiale cromosomico?

• A volte il plasmide F si integra nel cromosoma batterico grazie a sequenze di inserzione (IS) → queste cellule si chiamano Hfr (high frequency of recombination)

• Quando una cellula Hfr incontra una cellula F-, oltre il plasmide F viene trasferito anche DNA cromosomico

  • ma il trasferimento è lento e il ponte è fragile, quindi il cromosoma non viene trasferito mai completamente.

Meccanismo alternativo dei Gram positivi:

• Non usano i pili F (come enterococcus faecalis), ma usano ferormoni

• Rilasciati da cellule accettrici, si legano a recettori presenti sulle cellule donatrici (F+)

• Questa interazione induce il rilascio di sostanza aggregante da cellule donatrici, che forma accumuli che contengono il plasmide coniugativo, che quindi tramite questo, passano alle cellule provviste di ferormoni

I Farmaci Antimicrobici - Antibiotici

Con il termine “antibiotico” intendiamo sostanze prodotte da batteri o funghi in grado di inibire la crescita di altri microrganismi:

• Oggi è più corretto parlare di chemioantibiotici, perché molte di queste sostanze non sono più naturali ma prodotte in modo sintetico

La proprietà più importante degli antibiotici è la Tossicità Selettiva:

• Cioè essere tossici esclusivamente nei confronti del microrganismo, e non per le cellule eucariotiche dell’uomo.

• Questa selettività dipende da:

  • Assenza di molecole bersaglio per gli antibiotici nelle cellule eucariotiche

  • Diversa capacità di penetrazione del farmaco in un microrganismo rispetto una cellula eucariotica

  • Diversa affinità del farmaco per strutture funzionalmente, ma non strutturalmente simili → ad esempio un antibiotico può bloccare la sintesi proeica agendo sui ribosomi batterici, ma non su quelli delle cellule eucariotiche.

Caratteristiche dei farmaci antimicrobici

1. Natura dell’inibizione (indica come agisce il farmaco sul batterio):
   - Battericida → capace di uccidere la cellula batterica
   - Batteriostatica → capace di inibire la moltiplicazione batterica

2. Sprettro d’azione (indica quanti e quali microrganismi l’antibiotico riesce a colpire):
   - Ampio spettro → agisce contro molti tipi diversi di microrganismi (es:tetrociclina)
   - Spettro ristretto → agisce su uno specifico tipo di microrganismi

3. Meccanismo d’azione (indica quale bersaglio del batterio viene colpito dal farmaco):
   - Inibizione della sintesi della parete cellulare
   - Alterazione della membrana citoplasmatica
   - Inibizione della sintesi proteica
   - Inibizione della sintesi ed espressione degli acidi nucleici
   - Blocco di una via metabolica

D-CICLOSERINA

La D-Cicloserina è un antibiotico che imita una molecola fondamentale del batterio, la D-ALANINA che serve per costruire il peptidoglicano:

• Si impedisce la formazione del dimero di d-alanina, che lo fa legandosi al cofattore piridossal fosfato degli enzimi D-alanina recemasi e sintetasi

• Il batterio quindi non riesce a costruire la parete e muore

• Natura battericida e ampio spettro d’azione (gram + e -, rickettsie, micobatteri, protozoi)

VANCOMICINA E TEICOPLANINA

Antibiotici della famiglia dei glicopeptidi:

• Impediscono la formazione di legami peptidici trasversali tra i polimeri di peptidoglicano

• Quindi anche essi non fanno costruire bene la parete batterica

• Lo fanno legandosi alla sequenza D-alanina-D-alanina del peptidoglicano

• Natura battericida, ma stretto spettro d’azione (solo gram positivi)

Antibiotici Beta-Lattamici

Comprendono:

• Penicilline

• Cefalosporine

• Carbapenemi

• Monobattami

Elemento fondamentale è un anello beta-lattamico (a 4 atomi)

Come funzionano:

• Bloccano l’enzima transpeptidasi (PBP) legandosi ad esso, che sarebbe servito a formare legami tra le catene di peptidoglicano

• Anch’essi quindi non fanno formare la parete, così il batterio muore

Natura battericida, ampio spettro d’azione (gram + e -)

Antibiotici per infezioni da micobatteri

I micobatteri (es:tubercolosi) sono difficili da eliminare perché hanno una parete cellulare molto complessa composta da:

• Peptidoglicano

• Arabinogalactani

• Acidi micolici

Per questo si usano antibiotici specifici come:

• Isoniazide

  • è un profarmaco che si attiva dentro il batterio, per mezzo dell’enzima catalasi-perossidasi

  • attivato si trasforma in acido isonicotinico che si lega al NADH formando il complesso acile-NADH

  • questo complesso blocca la enoil-ACP reduttasi, importante per la sintesi degli acidi micolici, quindi la parete non si forma e il batterio muore

  • natura battericida e stretto spettro (micobatteri)

• Etambutolo

  • inibisce invece l’enzima arabinosil-transferasi, che serve per costruire arabinogalactani, altra componente importante della parete

  • così la parete non si forma correttamente e il batterio muore

  • natura battericida, stretto spettro (micobatteri)

• Rifampicina

  • Blocca la fase iniziale del processo di trascrizione legandosi alla subunità beta dell’RNA polimerasi

  • quindi blocca la sintesi proteica

  • natura batteriostatica (chat dice battericida), ampio spettro (micobatteri, gram + e -)

Antibiotici per infezioni fungine

Derivati Azolici (Imidazolici e Trazolici):

• Bloccano la sintesi degli steroli della membrana fungina, inibendo l’enzima 14-alfa-demetilasi (che distaccherebbe il gruppo metile dal lanosterolo, trasformandolo in ergosterolo)

• Natura battericida, stretto spettro (funghi)

Nistatina e Amfotericina B:

• Sono antibiotici polienici, cioè anfipatici, una regione idrofobica e una idrofilica che gli permette di inserirsi nella membrana

• Hanno come bersaglio l’ergosterolo, componente importante della membrana fungina

  • legandosi ad esso, si inseriscono nella membrana dove formano pori che destabilizzano la struttura facendo uscire ioni, zuccheri e metaboliti

  • così la cellula muore

• Natura battericida, stretto spettro (funghi)

Polimixine

Antibiotico formato da:

• Un peptide ciclico con cariche positive collegato tramite un tripeptide ad una catena di acido grasso

• In particolare si legano ai gruppi fosfato negativi del lipopolisaccaride (LPS) presente sulla membrana esterna dei gram negativi

• Questo legame danneggia la membrana, con conseguente morte del batterio

• Natura battericida, stretto spettro (gram -)

Antagonisti dei Folati

Il folato è un cofattore importante per numerose funzioni biologiche → con gli antagonisti dei folati, ne blocchiamo la sintesi da parte del batterio, quindi blocchiamo la crescita batterica.

Antagonisti dei folati:

• Sulfamidici → analoghi del PABA (acido para-aminobenzoico), inibiscono la sintesi del folato

  • natura batteriostatica, ampio spettro (gram + e -)

• Trimetoprim e Pirimetanina → analoghi del diidrofolato, inibiscono la diidrofolato reduttasi (DHFR), così non si forma tetraidrofolato (primetanina è importante per il plasmodium, malaria)

  • natura batteriostatica, ampio spettro

Il prof ha detto che gli antibiotici non li mette, quindi non continuo, sono arrivato qui alle fc

quindi pag 21-27 saltare

La coltivazione dei batteri - terreni di coltura

Il terreno di coltura rappresenta un mezzo artificiale attraverso cui i batteri possono crescere, svilupparsi ed essere studiati, le principali caratteristiche che deve avere sono:

• Nutrienti adeguati per la crescita batterica

• Giusta umidità

• pH adatto

• Sterilità

Componenti principali del terreno:

• Peptoni → derivano da proteine (caseina, soia) per idrolisi (acida o enzimatica)

• NaCl → aggiunta per necessità osmotiche richieste ad alcuni microrganismi

• Zuccheri → glucosio, lattosio, mannite

• Estratti di lievito, carne e d’organo → ricchi di fattori di crescita e sali

• Arricchimenti → sangue, emoglobina, vitamine per batteri più esigenti

• Supplementi selettivi → come antibiotici o sali biliari per bloccare alcuni batteri e favorirne altri

• Indicatori → sostanze coloranti (come il fenolo) che cambiano colore in base al pH, così da seguire il processo fermentativo del batterio in studio.

Classificazione dei terreni di coltura in base allo stato fisico

In base allo stato fisico distinguiamo terreni liquidi e solidi:

• Liquidi:

  • Sono brodi (senza solidificante)

  • Con lo sviluppo dei batteri il terreno diventa torbido → questo intorpidimento può essere uniforme, a granuli o solo in zone specifiche

• Solidi:

  • Differiscono per la presenza di un solidificante (agar)

  • L’Agar è un polisaccaride acido estratto da alcune alghe, il quale, disciolto a temperature maggiori a 80°C in un liquido, ne provoca la gelificazione durante il successivo raffreddamento

  • L’agar non è tossico per i batteri e solo pochissimi batteri sono in grado di depolimerizzarlo liquefacendo il terreno

Curva di crescita batterica

E’ il grafico che descrive come cresce una popolazione batterica nel tempo:

• Fase di latenza → qui non si osserva nessun aumento di batteri, perché prima devono sintetizzare gli enzimi necessari alla metabolizzazione dei substrati del terreno

• Fase di accelerazione di crescita → inizia la crescita e moltiplicazione

• Fase esponenziale o logaritmica → fase di crescita e divisione rapida

• Fase di decelerazione di crescita → i nutrienti piano piano si esauriscono e le scorie tossiche che aumentano andranno a ridurre la crescita

• Fase stazionaria → il numero di batteri che nascono e quelli che muoiono si bilanciano, quindi il loro numero rimane costante

• Fase di morte o declino → i batteri muoiono di più di quanto nascono

Curva di crescita diauxica (studiato da Monod):

• Particolare tipo di crescita, dove osservò che alcuni batteri coltivati in presenza di due zuccheri, uno semplice e uno più complesso, i batteri usavano prima lo zucchero semplice e poi quello complesso

• Si osservano così due fasi esponenziali separate da una pausa che serve al batterio per sintetizzare gli enzimi atti a metabolizzare il secondo substrato

Composizione chimica dei terreni di coltura

I tereni di base per batteri non esigenti sono:

• Brodo normale (liquido) → costituito da peptoni, estratto di carne, nacl e tampone fosfato (che mantiene ph intorno a 7)

• Agar normale (solido) → brodo normale + agar 1,5%

A questi terreni standard si possono aggiungere sostanze per coltivare batteri più esigenti, come:

• Sangue → arricchisce il terreno e permette di rilevare tossine emolitiche

• Siero → non solo arricchisce il terreno, ma elimina sostanze tossiche grazie all’albumina (che le lega)

• Liquido Ascitico

• Estratto di Lievito

Classificazione funzionale dei terreni di coltura

Classificazione in base alla funzione:

• Terreni di arricchimento (o elettivi) → favorisce la crescita del batterio di interesse

• Terreni selettivi → presenta sostanze batteriostatiche (come cirstalvioletti, sali biliari, tellurico di potassio) che inibiscono lo sviluppo di molte specie, isolando così solo quelli resistenti

• Terreni differenziali → consentono indicatori (di solido di pH) che permettono di distinguere i batteri in base al loro metabolismo

Preparazione di un terreno di coltura

1. Pesatura dei componenti

2. Aggiunta di acqua distillata

3. Solubilizzazione: agitazione fino a completa dissoluzione

4. Controllo del pH

5. Chiusura della beuta → non chiudere ermeticamente perché durante la sterilizzazione, la temperatura e pressione sale, quindi si ha rischio esplosione (in fase di raffreddamento). Per questo vengono usati tappi in cotone che permettono il passaggio d’aria per bilanciare la pressione

6. Sterilizzazione → con autoclave che raggiunge 120 gradi, alte pressioni (>1bar) per alcuni minuti, così uccidendo tutti i microrganismi. Se il terreno contiene sostanze termolabili come zuccheri e antibiotici, si usano tecniche di filtrazione

7. Raffreddamento → terreni liquidi raffreddati fino a 25°C, quelli solidi versati nelle piastre di Petri prima che solidifichino

8. Solidificazione (per agar)

9. Semina → si inocula il batterio nel terreno solidificato

Teniche di semina

La semina consiste nel depositare i batteri su un terreno di coltura. Le tecniche sono:

• Semina per isolamento (striscio)

  • La più usata

  • Con un ansa sterile si striscia sulla superficie dell’agar in varie zone per disperdere le varie cellule

• Semina per inclusione

  • Usata per la conta di colonie batteriche

  • Si mescola la sospensione batterica con un agar liquido che successivamente solidificherà

  • Spesso si fanno diluizioni (con NaCl 0,9%) per diminuire il numero di cellule seminare ed avere un numero contabile di colonie

• Semina per infissione

  • Avviene in provetta mediante un ago da inoculo che si infilza nel terreno agar molle

  • Permette di studiare la crescita in alto (aerobica), in basso (anaerobica) o diffusa (anaerobio facoltativo)

  • Permette di studiare anche la motilità del batterio, se la crescita è diffusa allora il batterio e mobile (flagelli)

  • Se uso Nutrient Gelatine testo l’attività proteolitica del batterio, se il batterio degrada la gelatina sarà proteolitico