Técnicas (biologia y genetica)

Modelos experimentales

• Estudios in vivo

• Estudios in vitro

• Estudios libres de células

Estudios in vivo

Animales

Estudio in vitro

Muestra homogeneizada

1. Se toma un pedazo de tejido

2. EL tejido se corta en fragmentos y se le pone una solución

3. Se destruye el tejido

4. Se agrega enzimas que rompen las uniones intracelulares y se separa todo el tejido

5. Se somete a una centrifugación quedando todas las células en el fondo y el liquido arriba

Estudios libres de celulas

Fraccionamiento subcelular

Fundamento 🡪 ruptura controlada de las células y la posterior separación de sus componentes mediante centrifugación diferencial o en gradientes de densidad

Uso 🡪 purificar o separar distintos componentes celulares para poder trabajar luego con alguno de ellos

Pasos

1. Lisis celular 🡪 se rompen las células mediante métodos mecánicos o químicos

2. Centrifugación diferencial 🡪 se aplican diferentes velocidades a la centrifugación para sedimentar (que se deposite en el fondo) los componentes celulares en función de su tamaño y densidad

Se pueden aplicar soluciones para separar con mayor precisión los orgánulos según su densidad

!!para saber que lo que obtuve es realmente lo que estoy buscando 🡪 pruebo actividad enzimática / observo al microscopio electrónico

Inmunocitoquímica / inmunofluorescencia

Fundamento 🡪 unión específica antígeno-anticuerpo + emisión de fluorescencia

• Unión específica antígeno-anticuerpo : los anticuerpos reconocen y se unen de forma específica a su antígeno, permitiendo identificar moléculas concretas dentro de la célula/tejido

• Emisión de fluorescencia : el anticuerpo está unido a un fluorocromo que emite luz indicando donde esta el antígeno

Usos 🡪 localización subcelular de proteínas

Pasos

1. Preparación de la muestra 🡪 se fijan células o cortes de tejidos en un portaobjetos

2. Incubación con anticuerpos primarios 🡪 añade anticuerpo que reconoce al antígeno de interés

3. Lavado 🡪 eliminar anticuerpos no unidos

4. Incubación con anticuerpos secundarios (opcional) 🡪 cuando es indirecta, se añade luego un anticuerpo secundario marcado con fluorocromo

5. Visualización 🡪 observación en microscopio de fluorescencia

Inmunohistoquímica

Cuando en la inmunofluorescencia/inmunohistoquímica se usa una enzima unida al anticuerpo

Western Blot

Fundamento 🡪 separación de proteínas mediante electroforesis en gel + transferencia a una membrana + detección mediante anticuerpos específicos (relación antígeno-anticuerpo)

Uso 🡪 detección y análisis de proteínas específicas, ademas de su peso molecular y cantidad relativa en una muestra biológica

Pasos

1. Preparación de la muestra 🡪 se sacan la proteínas y se usa un detergente para desnaturalizarlas

2. Electroforesis en gel 🡪 separan a las proteínas en función de su peso molecular mediante un campo eléctrico

3. Transferencia a membrana 🡪 las proteínas separadas son transferidas a una membrana mediante electrotransferencia

4. Bloqueo 🡪 solución con proteínas inespecíficas que evita uniones específicas de los anticuerpos

5. Incubación con anticuerpos primarios 🡪 aplicación de un anticuerpo específico contra la proteína de interés

6. Incubación con anticuerpos secundarios 🡪 se añade un anticuerpo marcado con una enzima de fluoróforo que reconoce al primario

7. Revelado y detección 🡪 sustrato químico o sistema quimioluminiscente para visualizar a la proteína diana

Limitaciones 🡪 basada en el uso de anticuerpos, y no siempre se encuentran buenos anticuerpos

Electroforesis en gel

Fundamento 🡪 utilizar un campo eléctrico y una membrana que funciona como filtro 

Uso 🡪 separar moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) por carga y tamaño 

Pasos

1. El ARN y ADN tienen cargas negativas. Las proteínas tienen carga positiva, entonces se les agrega un detergente con carga negativa 

2. Se coloca sobre un gel poroso (funciona como colador) y de esta manera las moléculas migran desde el extremo negativo hacia el positivo del gel 

3. La diferencia de cargas y tamaño de las moléculas hace que migran a diferentes velocidades por el gel

4. El tamaño de los fragmentos se estima comparando el patrón de bandas 

PCR punto final (convencional)

**Punto final porque la muestra solo se analiza una vez que se terminó la reacción (no se controla en tiempo real)

Fundamento 🡪 replicación in vitro de ADN mediante una enzima termoestable (sigue funcionando sin importar la temperatura a la que es sometida)

Uso 🡪 amplificar, obtener una gran cantidad de copias de un segmento de ADN a partir de una muestra mínima, de esta manera detecto deleciones o inserciones

Pasos

1. Desnaturalización del ADN = se separan las cadenas

2. Hibridación = unión por hibridación de los primers al ADN estableciendo el límite de la región que se quiere amplificar 

3. Extensión =  la taq polimerasa (tipo de ADN polimerasa que sobrevive al cambio de temperatura) comienza a funcionar 

4. Detección del producto amplificado = electroforesis en gel (separación de los fragmentos de ADN por peso molecular)

!!Ventaja → muy rápido y sensible (a partir de cantidades muy chicas de ADN)
!!Desventaja → necesito información previa de la secuencia para hacer cebadores

RT-PCR (PCR con retrotranscripción)

Variante de la PCR

Uso → diagnosticar personas sospechosas de infección por un microorganismo con genoma de ARN o mutación en el ARN

Hay retrotranscripción de una molécula de ARNm a través de la transcriptasa reversa

PCR tiempo real (cuantitativa)

Variante de la PCR

Permite observar los productos de amplificación en el mismo momento que está ocurriendo la reacción 

Analizamos la cantidad de ADN según el número de ciclos

PCR aleloespecifica

Uso —> mutaciones puntuales, sustituciones conocidas

Fundamento —> ADN polimerasa necesita un apareamiento perfecto en el extremo 3’ del cebador. Cebador para el alelo normal y otro para el alelo mutado, se va a amplificar solo si el cebador coincide exactamente

Limitación —> se debe conocer la mutación previamente

PCR-RFLP (polimorfismo en la longitud de fragmentos de restriccion)

Uso —> detectar sustituciones puntuales

Fumdaneto —> se amplifica el fragmento que contiene la mutación. Luego se utilizan enzimas de restricción (endonucleasas) cortan al alelo normal o el alelo mutado, y de esta manera obtenemos polimorfismo de tamaño y utilizamos electrofresis para separar los fragmentos

PCR múltiplex

Uso —> medicina forense, identificación de individuos

Fundamento —> amplificamos simultáneamente múltiples microsatelites (secuencias repetidas en tándem) y de esta manera logramos comparar perfiles

Limitación —> para identificar individuos, no diagnosticar mutaciones patogenicas

Enzima de restricción

Enzimas (endonucleasas) que tiene la capacidad de cortar el ADN doble de una cadena en secuencias específicas → produce fragmentos de ADN de distintos tamaños

TP-PCR

Uso —> detectar expansión de tripletes

Fundamento —> utiliza 3 cebadores (uno se une dentro de la repetición)

Limitación —> no sirve para mutaciones puntuales o deleciones comunes

Southern Blot

Fundamento 🡪 hibridación de una sonda marcada que es complementaria a la secuencia objetivo y posteriori electroforesis

Uso 🡪 detectar secuencias específicas de ADN dentro de una mezcla compleja  

Pasos

1. Tenemos una muestra de ADN homogeneizada y la purificamos (aislamos el ADN)

2. Cortamos al ADN con endonucleasas = generamos varios segmentos de ADN

3. Pongo los segmentos de ADN en la parte superior del gel

4. Enciendo la fuente de poder → por la corriente eléctrica los segmentos de ADN van a migrar a lo largo del gel (la velocidad va a depender del tamaño)

5. Sintetizó la sonda para la secuencia que quiero buscar + le agrego un marcador → luego se lo agrego a la muestra de ADN

Northern blot

Igual que el Southern blot pero no necesitamos cortar al ARN en segmentos ni desnaturalizarlo

Hibridación genómica comparada en micromatrices = CGH array

Fundamento 🡪 comparación del ADN de una muestra con el ADN referencia. Ambos se marcan con fluoróforos diferentes y se hibriden sobre un microarray que contiene secuencias específicas del genoma 

Microarray = superficie con miles de hoyos en donde se aloja miles de sondas para el genoma 

Uso 🡪 detectar pérdida, ganancia o duplicaciones de cromosomas enteros o regiones específicas   

Pasos 🡪 en cada hoyo se pone ADNc de cada muestra que compiten por las sondas que hay adentro. 

• Color intermedio = igual proporción de genoma 

• Sino hay más de uno que del otro → dependiendo a qué color se inclina más

CRISPR/CAS

Fundamento 🡪 sistema inmune bacteriano que, junto con la enzima Cas9, permite cortar ADN en sitios específicos 

Uso 🡪 edición genica

Pasos 

1. Se diseña un ARNguia que tenga una secuencia complementaria a la secuencia de ADN que queremos modificar

2. El complejo ARNguia+cas9 recorren el núcleo de la célula hasta que encuentran la secuencia de ADN complementaria blanco y la abren dejando como resultado una cadena doble de ARN+ADN y una cadena simple de ADN  

3. Una vez unidas la Cas9 hace un corte de doble cadena a las hebras del ADN

4. El cuerpo reconoce esta ruptura y activa mecanismo de reparación del ADN  

   1. Recombinación homóloga (HDR) → el complejo ARNguia+Cas9 tienen un molde de ADN diseñado por el investigador. La célula al ver el corte quiere arreglarlo, encuentra el molde y comienza a sintetizar el nuevo ADN para la segunda cadena 

   2. Unin de extremos no homologos (NHEJ) → no sabe lo que pidió entonces no sabe cómo repararlo = se unen los extremos produciendo una pérdida de gen

!!Ventaja → es más eficiente y rápida que la técnica de recombinación de ADN, hoy se utiliza más

Secuenciación de Sanger

Uso —> determinar la secuencia exacta de un gen

Fundamento —> reconstruir la secuencia utilizando florescencia (cada núcleotido tiene florescencia)

Limitación —> lenta, cara y un gen a la vez

Secuenciación de alto rendimiento (NGS)

Uso —> muchos genes candidatos

Fundamento —> secuencia de millones de fragmentos simultáneamente y luego comparación con genoma de referencia para detectar variantes

Cariotipo con bandeo

Uso —> Cromosomopatias estructurales grandes y numericas

Limitaciones —> mutaciones puntuales no

Fundamento —> cromosomas en metafase + tincion diferencial que permite identificar cada par cromosómico

VEO TODOS LOS CROMOSOMAS PERO CON POCA RESOLUCIÓN

FISH

Uso —> detectar presencia, ausencia, duplicación o reordenamiento de regiones genéticas

Fundamento —> hibidrcion por complementariedad de bases de una sonda de ADN marcada con fluorocromo

Limitación —> detecta solo alteraciones conocidas

VEO UNA REGION ESPECIFICA DEL CROMOSOMA PERO CON MUCHA RESOLUCIÓN