HC 3: Molecular methods in microbial ecology

Substrate Induced Respiration (SIR)

1. You give a substrate glucose of something else

2. watch how much respiration comes from that substrate.
   » So you measure the amount of CO2 coming from the sample.

• You can do this for cultures, or communities like soil sample.

• The idea is that you do this for multiple cultures or samples, and this way you can compare communities and different soils.

• You don’t know who’s doing it, just how much is happening.

Biolog

• Add microbial culture to each of 96 wells of plate, each contains different substrate

• Breakdown substrate induces colorimetric reaction.

• he amount of color says something about how well a culture breaks a material down.

• Compare to database for identification:

Other markers commonly used to detect microorganisms;

• rpoB gene

• Large subunit rRNA gene (25S in bacteria)

• ITS (spacer) regions, especially in fungi

PCR

• allows researchers to study microbial communities without cultivation
  » by directly amplifying microbial DNA from environmental sample

• This enables detection and quantification of microorganisms that may be difficult or impossible to grow under laboratory conditions

qPCR (quantitative PCR)

can tell you how many copies of a gene there are in a sample, so tell you how many of which bacteria are present.

• targeted identification and quantification tool.

Advantages of PCR-based community profiling

1. Highly sensitive —> you only need a small amount

2. Look at whole community at once

3. Can focus on a part of community, by using specific primers

4. Can identify bands by sequencing or databank comparison

disadvantaged of PCR-based community profiling

1. PCR-based (bias & difficult to quantify), also sensitive to contamination

2. Only see most dominant members

3. Only as good as the primers used

Fluorescent in Situ Hybridization (FISH)

• Hierbij dringt een fluorescerende probe (kort stukje DNA) de cel binnen en bindt aan een specifieke doelsequentie (vaak 16S rRNA)

• Alleen de delen/taxa waarvoor de probe affiniteit heeft, zullen oplichten onder de microscoop —> visualiseren van aanwezigheid en locatie van specifieke micro-organismen in hun natuurlijke omgeving zonder ze te hoeven isoleren

the basic strategy of community profiling methods

-      bekijken de gehele gemeenschap in één keer

-      DNA wordt geëxtraheerd, geamplificeerd en geanalyseerd om een soort vingerafdruk van de gemeenschap te  krijgen (vaak PCR-gebaseerd)

-      Door gebruik te maken van multiplexing/barcoding kunnen honderden monsters tegelijkertijd worden gesequenced in één run   —> de verkregen sequenties worden gegroepeerd in OTU’s/ASV’s om de structuur van de gemeenschap te vinden

Phospho-lipid Fatty Acid (PLFA) analysis

-      PLFA’s zijn bouwstenen van celmembranen en komen dus in alle levende micro-organismen voor

-      Ze dienen als biomarker, omdat de verschillende groepen micro-organismen (f.e. gram-positief/negatieve bacteriën of schimmels) unieke patronen van vetzuren hebben

PLFA voordelen

kwantitatief overzicht van aanwezige levende biomassa + biedt een vingerafdruk zonder de noodzaak voor PCR (en dus zonder PCR-bias)

PFLA nadelen

-      minder specifiek dan DNA-gebaseerd (het identificeert groepen, maar meestal niet op soortniveau) + meer een algemene community-level vingerafdruk