Expansion microscopy- Dudin

Rappel:

Pour voir structure specifique dans cellule ex. proteine

Pour voire cellule vivante ?

• Marquer avec anticorps. Nécessite que cellule soit fixée donc morte

• vivante: ex: GFP

Probleme de visualisation des centrioles

• centriole est structure conservée, soir tt les eukaryote ont avec meme structure

• ultrastructure: 9 fold symmetry de la centriole, barrel structure. 300-500nm de haut x 250 de largeur

• diffraction limit of microscope (normal confocale) is 200nm, soit insuffisant pour voir ultrastructure.

• STEPS avec resolution 50nm, on voit un peu mieux

• dSTORM aussi un peu mieux

• avec rien de ca on voir bien ultrastructure (voir autres techniques )

Conventional fluorescence vs super-resolution microscopy:

techniques différentes & leur resolution

• fluorescence microscopy

• super-resolution microscopy

• X-ray microscopy

• cryo electron microscopy + probleme

• fluorescence microscopy : 200nm ish

• super-resolution microscopy : 20-10nm

• X-ray microscopy: 20nm ish

• cryo electron microscopy : 1nm, impossible d’utiliser anticorps avec cryo donc d’identifier structures spécifiques

Nouvelle méthode to fill gap: expansion microscopy:

• what are we improving w/ ExM?

• explain ExM idea behind

• dead or alive cells ?

• avantage ?

• improving the sample instead of the microscope. expanding isotropically (dans tt les sens de la meme maniere)

• Ttes prot ont amines NH3. Idée est d’ancrer ttes les prot à travers grpes amines & de créer un polymère avec ttes les prot dans ttes les cellules. Crée une “matrice”, cellule expands

• dead cells only, utilise anticorps

• cheap & meilleure resolution, increases throughput, can save samples and use. Peut voir organelles.

steps (exact) of expansion microscopy

1. On fixe les cellules: on fixe un échantillon à un moment précis.

2. Ancrer les protéines

3. permettre au polymère — sodium acrylate de se polymeriser dans tt ces points. (swellable polymer)

4. pour permettre expansion, on donne flexibilité: on dénature tt ce qui n’est pas ancré

5. Là quand on donne de l’eau, cellule expands.

6. Staining avec anticorps

2 protocoles d’ExM & différence de protocole

différences dans les images.

1. Pre-expansion labelling : fixe cellules, met anticorps, ancrer & expandre.

2. Post expansion labelling : fixer cellules, ancrer, expandre & mettre anticorps à la fin

• Pre-expansion (called ExM dans images) qualité + nulle que postexp (called U-ExM) mais cv. ExM completement bancal pour axe z.

• Post-expansion permet de voir ultrastructure du centriole

si anticorps n’entrent pas dans organisme ?

si anticorps n’entrent pas dans organisme, post expansion est plus efficace car on a expand/ structure a changé & anticorps peuvent probablement entrer.

Matériaux pour:

• fixation chimique (fixe cell à moment )

• fixation cryo

• fixation chimique: formaldehyde, glutaraldehyde, methanol, acetone. Can use them in combination or sequentially. Tue cellule, risque de former artefacts

• fixation cryo: fixation par froid, vitrification soit pas de cristaux tellement on freeze vite.

• -Soit freeze plunging (plonge echantillon in cold ethane)

• - soit high pressure freezing (augmente tellement pression que echantillon est fixé)

avantages fixation chimique vs cryo

• chimique: Large sample volume, No additional equipment/gases, On site field experiments, Minimum post processing, Scalable to large sample number

• crypo: Better preservation of structures, Essential to permeabilise certain cell wall. grosses machines.

Variations in staining:

describe antibody labelling

• le fait de mettre 2 anticorps amplifie le signal.

Variations in staining:

• NHS ester

• Lipid BODIPY ceramide

• on peut combiner ces markeurs entre eux + anticorps

NHS marker marque tt les groupes amines donc ttes les prot

facts de fin de cours

• technique nous a permis de voir quenveloppe est maintenue pendant la mitose

• diatomee a couche en verre, anticorps nentrent pas. Via cryo, couche en verre est brisée. a permis de voir organelles.