7 molekulines pask

Kuo skiriasi prokariotai nuo eukariotų iš baltymų sintezės pusės?

Prokariotuose:

• viskas yra vienoje erdvėje ir viskas vyksta kartu:

  • DNR

  • RNR

  • Baltymai

• Baltymų sintezė vyksta nuo transkribuojamos RNR

Eukariotuose :

• yra erdviniai atskyrimai:

• RNR transkripcija branduolyje

• RNR brendimas

• Po to transportas į citoplazmą

• Baltymų sintezė citoplazmoje

kas yra transkripcija?

Transkripcija – procesas, kurio metu pagal matricą – DNR grandinę – sintetinama jai komplementari RNR molekulė

Ar visa DNR molekulė yra nuskaitoma į RNR?

Tik tam tikros jos zonos

Ar visa nuskaityta RNR vėliau bus transliuojama į baltymus?

ne

kaip vadinasi sritis, kuri parodo transkripcijos pradžią? pabaigą?

promotorius - pradžią

terminatorius - pabaigą

kas yra genas?

Genas – paveldimą informaciją koduojanti sritis nuo promotoriaus iki terminatoriaus. transkripcijos vienetas.

Vykstant genų raiškai, skirtingos genų sritys gali atlikti skirtingas funkcijas (gali koduoti baltymą, būti reguliacinės sritys…)

• Transkripcijos vienete gali būti daugiau nei vienas genas. Tai galioja ypač bakterijose, nes transkripcijos vienetas yra nebūtinai tas pats kas vienas genas

Kas yra svarbiausias genų raiškos valdymo lygmuo?

Transkripcija

Kas yra atskaitos taškas transkripcijoje? kaip kitos sritys vadinasi, ka jos daro?

• +1, ten prasideda transkripcija

• į dešinę pusę yra pasrovinės. + skaičiai. jos yra transkribuojamos

• į kairę pusę yra neigiami skaičiai - priešsrovinės sritys. jos reguliuoja - lemia, kad toje vietoje bus pradėta transkripcija. jos nėra transkribuojamos

Kaip vadinamos DNR grandinės dalyvaujančios transkripcijoje?

• DNR grandinė, pagal kurią sintetinama transkripcijos metu (transkribuojama) – Matricinė grandinė (template)

• Kita (jai komplementari) DNR grandinė – Koduojančioji grandinė (coding)

Koduojančios grandinės nukleotidų seka yra identiška susintetintai RNR molekulei, išskyrus tai, kad vietoje timino (T) yra uracilas (U).

Kokia kryptimi vyksta RNR transkripcija?

Transkripcijos (RNR sintezės naudojant DNR kaip matricą) kryptis - 5’→3’

Kas yra transkripcijos burbulas?

Sritis, kurioje yra išskiriamos dvi DNR grandinės ir sintetinama RNR

Koks fermentas vykdo transkripcija?

RNR polimerazės

kaip vadinasi Viengrandinių ir dvigrandinių DNR fragmentų susijungimo taškas?

šakutės susijungimo taškas

Transkripcijos burbulas. iš kur gaunama energija RNR polimerazei judėti?

• Transkripcijos burbule DNR grandinės yra laikinai išskirtos

• Burbulas (~12 -15 nt.) juda kartu su RNR polimeraze

• DNR/RNR hibridas:

  • Trumpas (7-9 b.p.)

  • Laikinas

  • Kinta judant RNR polimerazei DNR atžvilgiu

• Energija RNR polimerazei judėti gaunama dėl NTP jungimo

DNR koduojami transkripcijai svarbūs elementai

• Promotorius (ir kt reguliacinės sekos)

• Funkcinę RNR koduojanti sritis (iRNR)

• Terminatorius

cis ir trans reguliaciniai elementai

• DNR nukleotidų sekų koduojami transkripcijos pradžios ir pabaigos signalai – cis veiksniai

• Transkripcijoje dalyvaujantys baltymai juos atpažįsta – trans veiksniai

DNR sritys taip pat gali būti trans veiksniais (eukariotuose) - kai, pvz., užsilenkia grandinė

Promotorius

• DNR nukleotidų seka (sritis), aktyvinanti transkripciją (promotorius, promoter) nustato geno transkripcijos pradžios nukleotidą (+1)

  • Jį atpažįsta transkripcijos veiksniai, kurie parodo, kur polimerazė turės jungtis

  • Ten jungiasi RNR polimerazė

• Nuo čia RNR polimerazė pradeda RNR sintezę (transkripcijos iniciacija)

Prokariotuose, reguliacinės sritys išsidėstę prieš srovę nuo transkripcijos pradžios, eukariotuose jos gali būti nutolę

Prokariotų promotoriaus elementai

• -10 elementas (TATA)

• -35 elementas (pavadinta pagal tai per kiek bp yra nutolusios nuo +1 , tačiau tas atstumas gali ir varijuoti)

• Optimalus atstumas tarp -35 ir -10 (17 nt)

• UP elementa - AT turtinga sritis ties -40 - 60)

• +1 transkripcijos pradžia - Dažniausiai purinas

iRNR

• iRNR – baltymus koduojanti RNR

• Ribosomų prijungimo sritis (ribosome binding site) RBS

• Transliacija prasideda netoli šios vietos

• Galima išskirti iRNR koduojančias (baltymą) ir nekoduojančias sritis

• iRNR (dažniausiai bakterijų, bakteriofagų) gali būti policistroninė , t.y., transkriptas gali koduoti daugiau nei vieną polipeptidą

Transkripcijos terminatoriai

• Terminatoriai gali būti:

  • Koduojami DNR arba (cis)

  • Nuo DNR sekos nepriklausomi (trans). Baltymai, pvz. Rho, kuris prisijungia prie sintetinamos RNR ir sustabdo transkripciją

• DNR koduojmai nuo veiksnių (Rho) nepriklausomi arba vidiniai terminatoriai (intrinsic terminators)

  • GC turtingas invertuotas pasikartojimas

  • U turtinga sritis už jo

Kai terminatoriai yra koduojami pačioje DNR, tai pačioje DNR sekoje yra sukoduojama dvi komplementarios viena kitai sritys, kai susintetinama RNR, jos susilenkia ir suformuoja segtuką (plaukų segtuko forma) ir tokia sritis rod, kad čia reikia užbaigti transkripciją.

Transkripcijos etapai

• Iniciacija

• Sintezė (elongacija)

• Terminacija

• Visuose etapuose vyksta DNR ir baltymų sąveikos

• Baltymai – transkripcijos veiksniai ir RNR polimerazė, atrankiai sąveikauja su DNR sritimis ir tarpusavyje

Transkripcijos iniciacija

• Promotorių atpažįsta transkripcijos veiksniai

• Užtikrina RNR polimerazės prijungimą prie promotoriaus ir uždaro komplekso – RPc susidarymą (closed). RP: RNR polimerazė Promotorius

  • DNR dvigrandinė – burbulas neatsivėręs

• DNR grandinės netoli pirmojo transkribuojamo nukleotido išskiriamos, susidaro atvirasis kompleksas – RPo (open )

  • Atsivėręs transkripcijos burbulas

Transkripcijos Elongacija ir terminacija

Elongacija

• RNR polimerazė sintetina RNR molekulę

• Produktyvusis etapas

Terminacija

• Terminacijos signalai lemia RNR polimerazės disocijaciją iš transkripcijos komplekso • Transkripto atpalaidavimas

RNR polimerazės

Transkripciją vykdo nuo DNR priklausomos RNR polimerazės:

• Konservatyvūs baltymai bakterijų, archėjų, eukariotų gyvybės domenuose

• Konservatyvi jų katalizinės šerdies struktūra ir funkcijos

• Sudaro daugiasubvienetinių RNR polimerazių šeimą (RNAP)

krabo žnyplių forma

Iš ko sudarytas RNAP skirtinguose organizmuose?

RNAP sudarytos iš keliųkeliolikos baltymų (subvienetų)

• Bakterijų iš 5

• Archėjų iš >10

• Eukariotų iš >10

Prokariotų vs eukariotų polimerazės

Prokariotų ir eukariotų RNR polimerazių aminorūgščių sekos nepasižymi dideliu panašumu

Tačiau prokariotų ir eukariotų RNR polimerazių struktūra yra panaši

RNR polimerazių katalizuojama reakcija

RNR polimerazė

• Jungia NTP (rNTP )

• Sukuria fosfodiesterinį ryš į

• Atpalaiduoja pirofosfat ą

RNR polimerazės užtikrina:

• RNR sintezę

  • NTP jungimą

  • Fosfodiesterinio ryšio susidarymą

  • Pirofosfato atpalaidavimą

• Fermento perstūmimą matricos atžvilgiu

• Sintezės tikslumą

Kuo skiriasi RNR polimerazė nuo DNR polimerazės?

Kitaip nei DNR polimerazėms, RNR polimerazei pradmens nereikia!

• Du pirmieji NTP turi būti tiksliai išdėstyti fermento aktyviajame centre

• Pirmasis jungiamas nukleotidas dažniausiai yra ATP arba GTP (adenin arba guanin trifosfatas)

prokariotų vs eukariotų RNR polimerazės

Prokariotuose – viena RNR polimerazė :

• Sintetina visas RNR

• Išskyrus RNR pradmenis replikacijos procesui (praimazės)

Eukariotuose – 5 - 6 RNR polimerazės:

• sintetina tam tikras RNR grupes

Bakterijų RNR polimerazių struktūra

• Šerdinė dalelė (apie 400 kDa )

• 2 α subvienetai ( αI, αII)

• β suvienetas

• β‘ subvientas

• ω (omega) subvientas

• Holofermentas

• + σ (sigma)

Prokariotų RNR polimerazės subvienetų funkcijos

Bakterijų RNR polimerazė - plyšys tarp žnyplių

• Plyšys talpina DNR, pagrindinis kanalas pereina į RNR išėjimo kanalą

• Plyšio vidus yra išklotas teigiamai (+) įkrautomis a.r.

• Giliausiame taške – aktyvusis centras

Kas čia?

Bakterijų RNR polimerazė

Kas čia, kokios funkcijos sričių?

β ir β‘ subvienetai formuoja pagrindinę RNR polimerazės struktūrą, atsakingi už katalizę ir nukleorūgščių orientavimą

Du α subvientai jungiasi išorėje ir svarbūs sąveikai su DNR

ω subvienetas svarbus dalelės susimontavime

Kas čia pavaizduota? kas vyksa?

Pagrindiniame kanale išdėstoma DNR

Susintetinta RNR išeina kitu kanalu

Sintezė vyksta aktyviajame centre

Antriniu kanalu patenka NTP

Bakterinės RNR polimerazės šerdinė dalelė

• Šerdinė RNR polimerazės dalelė gali sintetinti RNR, tačiau pasižymi nedideliu giminingumu DNR

• Gali prisijungti prie bet kurios DNR nukleotidų sekos panašiu giminingumu

• Nėra atrankumo promotoriams - RNAP, nors ir pasižymi kataliziniu aktyvumu, negali inicijuoti RNR sintezės ties genų promotoriais

• Prisijungus prie DNR, šerdinėje dalelėje nevyksta jokie erdviniai pokyčiai

Bakterinės RNR polimerazės holofermentas

• Kartu su σ subvienetu šerdinė RNAP dalelė sudaro holofermentą

• Polimerazės šerdinės dalelės giminingumą DNR keičia prie jos prisijungęs σ veiksnys

  • Holofermentas žymiai silpniau jungiasi prie bet kurios (atsitiktinės) DNR (disocijacijos pusperiodis < 1 s)

  • Tačiau atrankiai jungiasi prie promotorių DNR (disocijacijos pusperiodis keletas valandų)

• Holofermente σ veiksnys daugeliu tarpmolekulinių ryšių sąveikauja su šerdinės dalelės β ir β’ subvienetais

---

• Stabilią RNR polimerazės holofermento sąveiką su DNR lemia s veiksnys

• σ veiksnio konservatyvūs domenai sąveikauja su savitosiomis promotorių sritimis

• Sąveikoje su promotoriumi taip pat dalyvauja RNR polimerazės šerdinės dalelės subvienetai

• Sąveika užtikrina tikslų RNAP išdėstymą transkripcijos pradžios nukleotido atžvilgiu

Promotoriaus reguliacinių sričių sąveika su RNAP

• Šerdinės dalelės α subvienetų C galiniai domenai:

  • atpažįsta UP elementaą: A/T turtinga DNR sritis -40 -60 priešsrovinė sritis. Šis elementas nėra būtinas

• σ veiksnys:

  • -35 priešsrovinis heksameras

  • -10 priešsrovinis heksameras (Pribnov dėžutė/seka)

Promotorių reguliacinių sričių įvairovė

• Promotorių tipiškos sekos lemia promotorių stiprumą – transkripcijos iniciacijų skaičių per laiko vienetą

• Evoliucijos procese promotorių tipiškos sekos susidarė taip, kad užtikrintų vieno ar kito geno transkripcijos poreikius

• Genų, kurie koduoja RNR ir baltymus, kurių reikia didelių kiekių, promotoriai daug stipresni (pvz., rRNR ir ribosominių baltymų) nei tų, kurių produktų reikia nedaug.

• Dauguma bakterijų turi tipini s veiksnį (E.coli – σ ⁷⁰), atpažįstantį tipinius promotorius

• Alternatyvūs (kitokie) σ veiksniai atpažįsta savitus, skirtingos struktūros promotorius. Tų sigma veiksnių yra dau skirtingų

---

Dalis iš paveikslėlyje pavaizduotų sričių aiškiai sako TATA, dalis sako visai ką kito. Kuo šios sritys (-10 ir -35) bus artimesnės standartinei sričiai, tuo stipriau su jomis sąveikaus σ veiksnys ir tuo dažniau inicijuos traskripciją. Taip reguliuojama, kurių baltymų reikia daug, kurių mažiau.

Transkripcijos ciklas

• Transkripcijos proceso etapai:

  • Surandamas promotorius (promotoriaus atpažinimas)

  • Prasideda RNR sintezė (iniciacija)

  • RNR polimerazė sintetina RNR grandinę (elongacija)

  • Priėjus terminacijos signalus, transkripcija sustoja (terminacija)

Promotoriaus atpažinimas (iniciacija)

• Bakterinė RNR polimerazė su σ veiksniu suranda promotorių (randa -10 ir -35 sritis)

• σ veiksnio sritys atrankiai sąveikauja su promotoriaus elementais

• Susidaro uždaras RNR polimerazės/Promotoriaus DNR kompleksas - RPc

  • RPc komplekse DNR grandinės nėra išskirtos, transkripcijos burbulas nesusidaręs

• Šiame etape DNR molekulė dar nėra išdėstyta fermento pagrindiniame kanale. Jis yra uždaras

Jei šis darinys yra pakankamai stabilus, jis galiausiai pavirs atviru

Atvirojo komplekso (RPo) susidarymas (iniciacija)

• Atvirojo komplekso RPo susidarymas:

  • Grandinės išskiriamos tik nedideliame duplekse

  • RNR polimerazėje ir DNR vyksta erdviniai pokyčiai

  • DNR (+1) išdėstoma fermento kanale, kur yra aktyvusis centras

  • Kanalas “užsidaro”

• Atviras RNR polimerazės/DNR kompleksas labai stabilus

• RNR polimerazė jau gali jungti nukleotidus, t.y., pradėti RNR sintezę

Visa tai vyksta tada kai susidaro teisingas kompleksas, kai teisingoje vietoje tas kompleksas išsilaiko, visi elementai yra savo vietoje, RNR polimerazė pakeičia konformaciją ir DNR yra įtraukiama į jos krabo žnyplės vidų.

Transkripcijos iniciacija. detaliai

• Aktyviajame centre išdėstomas pirmasis rNTP, kuris komplementarus matricos nukleotidui +1 padėtyje

• Katalizinė reakcija įvyksta prisijungus antrajam NTP kuris komplementarus matricos nukleotidui +2 padėtyje;

• Susidaro iniciacijos RPinit (RPitc) kompleksas

  • Promotoriaus sritys nejuda

• RNR kartu su matrica stumiama link RNR išėjimo kanalo

• Kol dar yra σ veiksnys, DNR suspaudžiama išėjimo kanale ir išlinksta

• Toks RNR sintezės ir stūmimo ciklas kartojasi keletą kartų – gaunamas “sugrūstas” (scrunching) iniciacijos kompleksas RPinit

• Perėjimą iš iniciacijos fazės į sintezės fazę stabdo nutrūkstamoji iniciacija (abortive innitiation) – susintetinta trumpa RNR paleidžiama iš komplekso, netęsiama

• Iniciacijos fazė pasibaigia, kai RNAP pavyksta susintetinti ilgesnį nei 10-12 nt. transkriptą. Tada ji išsumia σ veiksnys iš tos vietos ir RNR polimerazė gali pajudėti.

σ veiksnys užima tą kanalą, per kurį turėtų išeiti. Ateina nukleotidai ir kai jua pradedama sintetinti raudonai pavaizduota RNR molekulė šitas kompleksas vadinasi iniciacijos kompleksas (RPinit). tačiau šis kompleksas negali judėti nes σ veiksnys yra labai stirpiai įsikibęs tos vietos, kur atpažino promotorinę sritį. RNR polimerazė vis tiek sintetina RN ir ji yra grūdama. … Viso to reikia patikrinti, kad tikrai viskas tinkamai susidarė.

Elongacija. detaliai

• Disocijavus sigma veiksnys, įvyksta erdviniai pokyčiai.

• Transkripcijos kompleksas RPelong, arba TEC palieka promotorių ir vykdo procesyvią RNR sintezę, lengvai juda į priekį

• RNAP sąveika su DNR stipri, RNR sintezė vyksta, kol nepasiekiama terminacijos sritis

  • Fermentas disocijavus nuo DNR matricos anksčiau, nei pasiekiama terminacijos sritis, transkripcija nutrūksta

  • RNR polimerazės nebegali toliau prisijungti ir ilginti atsipalaidavusių transkriptų (Nutrūkusi DNR sintezė tęsiama, o nutrūkusi RNR sintezė - ne)

• Kai transkripcijos kompleksas palieka promotorių, prie promotoriaus gali prisijungti kitas RNR Pol holofermentas

• Inicijacijos proceso greitis lemia, kaip greitai bus pradėta ilginti grandinė ir polimerazė paliks promotorių

Tikslumo kontrolė

• RNR polimerazė taiso klaidas

• Klaidų dažnis – 10^-4 -10^-5

• Įjungus nekomplementarų nukleotidą, polimerazė „grįžta atgal“ (backtracking)

• RNR 3‘-galas patenka į NTP patekimo kanalą ir jį uždaro

• Pasireiškia skeliantis transkripto galą RNR Polimerazės endonukleazės aktyvumas, kurį stimuliuoja elongacijos veiksniai GreA ir GreB

Terminacija detaliai

• Bakterijose yra dviejų tipų transkripcijos terminacija:

  • Nuo Rho veiksnių priklausoma

  • Nuo Rho nepriklausoma

• Nuo veiksnių (Rho) nepriklausomi vidiniai terminatoriai (intrinsic terminators):

  • Užkoduoti DNR sekoje

  • Nurašomi per transkripciją

• Pirminiame transkripte sudaro antrines struktūras, lemiančias terminaciją:

  • Segtuką (daug G-C porų)

  • RNR 3’ poliU galą, silpnai sąveikaujantį su DNR matrica

Nuo veiksnių (Rho) nepriklausomi vidiniai terminatoriai

Nuo Rho priklausoma terminacija

• Rho baltymas

  • Gyvybiškai svarbus bakterijoms

  • Heksamerinė helikazė, gali išskirti RNR/DNR dupleksą

• Rho veikimui reikia galimybės prisijungti prie ne mažiau kaip ~60 nt ilgio viengrandinės RNR

• Kuo ilgesnė seka, tuo geriau vyksta terminacija

-

• Per Rho heksamero plyšį į vidų pakliūna RNR

• Per heksameto domenus vinguriuoja ~ 60 nt RNR

• Dėl ATP prijungimo ir hidrolizės sukeliamų konformacinių pokyčių baltyme;

  • RNR juda per Rho subvienetus

  • Pasiekia transkripcijos elongacijos kompleksą ir sukelia jo disocijaciją

• Rho terminacija negalima, jei RNR formuoja antrines struktūras