Métodos - Tema 1B: Aplicaciones bioquímicas de la espectroscopía de absorción UV-visible

¿Cuáles son las tres regiones y categorías de cromóforos presentes en el espectro de absorción UV-visible de las proteínas?

• 200 nm (UV lejano): Absorción del enlace peptídico

• 280 nm (UV próximo): Absorción de las cadenas laterales de aminoácidos aromáticos (triptófano, tirosina y fenilalanina)

• >350 nm (Región visible): Absorción de grupos prostéticos asociados a ciertas proteínas

En la región de 200 nm de las proteínas, ¿cuál es el cromóforo responsable, qué transiciones electrónicas ocurren, cuál es su coeficiente de extinción molar y por qué no es muy útil para identificar proteínas de forma específica?

• Cromóforo: El enlace peptídico

• Transiciones electrónicas: Ocurre sobre todo la excitación π → π* (por el doble enlace) y, en menor proporción, transiciones n → π* debidas a los electrones no enlazantes del oxígeno y nitrógeno

• Coeficiente de extinción molar: ɛ₂₀₀^1M= 7,000 M^-1 cm^-1

• Utilidad: Aunque es la banda de absorción más intensa, no es específica, ya que muchos otros compuestos biológicos y tampones absorben fuertemente en esta zona del UV lejano

En la región de 280 nm, ¿cuáles son los cromóforos responsables y cuál es su relevancia analítica?

• Cromóforos: Cadenas laterales de aminoácidos aromáticos: triptófano (Trp), tirosina (Tyr) y fenilalanina (Phe) (en mucha menor proporción)

• Relevancia: Es la banda de absorción característica, diferencial e identificativa de las proteínas. Por su notoriedad, se tienen en cuenta principalmente Trp y Tyr

¿Por qué es necesario desnaturalizar una proteína para determinar su contenido de Trp y Tyr, y cómo se cuantifica con cloruro de guanidinio 6 M?

Es imprescindible desnaturalizarla porque el microentorno local (polaridad, plegamiento) afecta al comportamiento espectroscópico de Trp y Tyr; al desnaturalizar, ambos quedan expuestos de forma homogénea

• Se trata como una mezcla de dos cromóforos y se miden las absorbancias a 280 nm y 288 nm:

$$A_{280} = A^{\text{Trp}}_{280} + A^{\text{Tyr}}_{280} = \varepsilon^{\text{Trp}}_{280} \cdot c^{\text{Trp}} \cdot l + \varepsilon^{\text{Tyr}}_{280} \cdot c^{\text{Tyr}} \cdot l$$

$$A_{288}=A_{288}^{\text{Trp}}+A_{288}^{\text{Tyr}}=\varepsilon_{288}^{\text{Trp}}\cdot c^{\text{Trp}}\cdot l+\varepsilon_{288}^{\text{Tyr}}\cdot c^{\text{Tyr}}\cdot l$$

• Al resolver el sistema de ecuaciones:

$$c^{\text{Trp}} = \frac{A_{288}}{3\,103} - \frac{A_{280}}{10\,318}$$

$$\text{nº Trp} = \frac{c^{\text{Trp}}}{c^{\text{prot}}}$$

• La concentración de triptófano es la concentración de la proteína por el número de triptófanos que hay en la proteína

¿Cómo se realiza la determinación de Trp y Tyr desnaturalizando la proteína a pH 13 y a qué corresponde la longitud de onda de 294,4 nm?

A pH 13 se miden las absorbancias a 280 nm y 294,4 nm:

$$A_{280} = A^{\text{Trp}}_{280} + A^{\text{TyrO}}_{280} = \varepsilon^{\text{Trp}}_{280} \cdot c^{\text{Trp}} \cdot l + \varepsilon^{\text{TyrO}}_{280} \cdot c^{\text{TyrO}} \cdot l$$

$$A_{294{,}4} = A^{\text{Trp}}_{294{,}4} + A^{\text{TyrO}}_{294{,}4} = \varepsilon_{294{,}4} \left(c^{\text{Trp}} + c^{\text{TyrO}}\right) l$$

La longitud de onda de 294,4 nm es un punto isosbéstico, donde los coeficientes de extinción de ambas especies coinciden ($\varepsilon^{\text{Trp}}_{294{,}4} = \varepsilon^{\text{TyrO}}_{294{,}4} = \varepsilon_{294{,}4}$), simplificando el cálculo de la concentración total

En la región de 350 nm (espectro visible), ¿a qué se debe la absorción en proteínas y qué ventaja experimental aporta?

• Se debe a la presencia de grupos prostéticos (como el grupo hemo en la hemoglobina)

• Son muy útiles porque son específicos de proteínas con un grupo particular y permiten estudiar la conformación y el funcionamiento catalítico/biológico, ya que las propiedades espectroscópicas del cromóforo se alteran según el estado funcional de la proteína

• Su especificidad diferencial permite en muchos casos estudiar la proteína sin necesidad de purificarla al 100%

En el estudio de la oxihemoglobina vs. desoxihemoglobina, ¿a qué longitud de onda se observa el cambio espectral máximo y cómo se calcula la fracción de sitios ocupados por O₂?

• El cambio máximo de absorbancia entre ambas conformaciones se observa a 576 nm (o 577 nm)

  • Conforme aumenta la presión parcial de O₂, el espectro transita progresivamente de desoxihemoglobina a oxihemoglobina pasando por varios puntos isosbésticos

• La fracción de sitios ocupados (desde 0% hasta 100%) se calcula como:

  $$\text{fracción de sitios ocupados} = \frac{A_{576} - A_{576}^{\text{desoxi}}}{A_{576}^{\text{oxi}} - A_{576}^{\text{desoxi}}}$$

¿De dónde sale la fórmula de fracción de sitios ocupados?

A una longitud de onda determinada (576 nm), podemos medir la absorbancia de:

• Hemoglobina completamente desoxigenada: (A₅₇₆^desoxi). Representa el 0 % de sitios ocupados por oxígeno

• Hemoglobina completamente oxigenada: (A₅₇₆^oxi). Representa el 100 % de sitios ocupados por oxígeno

• Si tenemos una muestra con una parte de hemoglobina oxigenada y otra parte desoxigenada, su absorbancia será una combinación de ambas:

$$A_{576}=f\cdot A_{576}^{oxi}+\left(1-f\right)\cdot A_{576}^{desoxi}$$

$$A_{576}=f\cdot A_{576}^{oxi}-f\cdot A_{576}^{desoxi}+A_{576}^{desoxi}$$

$$A_{576}-A_{576}^{desoxi}=f\left(A_{576}^{oxi}-A_{576}^{desoxi}\right)$$

$$f=\frac{\left(A_{576}-A_{576}^{desoxi}\right)}{\left(A_{576}^{oxi}-A_{576}^{desoxi}\right)}$$

¿Qué es la metahemoglobina (MetHb), cómo se genera in vitro y a qué longitud de onda tiene su máximo?

• Se produce cuando el hierro ferroso (Fe²⁺) se oxida a férrico (Fe³⁺). In vitro ocurre en medio alcalino en presencia de ferricianuro potásico

• La forma Fe³⁺ no permite la unión reversible de O₂ (patología de metahemoglobinemia)

• Su espectro cambia, situando un máximo de absorción en 540 nm

¿Por qué y cómo se estudia la hemoglobina en la región del infrarrojo cercano (NIR, ∼ 1000nm)?

• Aunque la absorbancia de la hemoglobina en NIR es menor que en el visible, la radiación infrarroja cercana penetra varios centímetros en los tejidos biológicos vivos

• Imagen fotoacústica de vasos sanguíneos: Se envía un pulso láser NIR; la absorción por la hemoglobina genera una expansión térmica local transitoria que emite ondas acústicas/ultrasónicas. Un detector de ultrasonidos las capta, permitiendo reconstruir imágenes de la vascularización en tejido vivo y diferenciar fracciones oxigenadas de desoxigenadas

En los ácidos nucleicos, ¿cuáles son los cromóforos, qué transiciones electrónicas presentan, a qué longitud de onda absorben y cómo difieren purinas y pirimidinas?

• Cromóforos: Los anillos aromáticos de las bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina, timina y uracilo)

• Transiciones electrónicas: Presentan transiciones π → π* (por los dobles enlaces conjugados en resonancia) y transiciones n → π* debidas a los pares libres de los átomos de oxígeno y nitrógeno

• Banda de absorción: Centrada en el UV próximo alrededor de 260 nm

• Diferencia relativa: Las bases púricas absorben ligeramente más que las pirimidínicas debido a que poseen un mayor número de dobles enlaces conjugados en sus dos anillos fusionados

¿Cuáles son las longitudes de onda de máxima absorción (λ_max⁡​) características para distinguir proteínas de ácidos nucleicos en el UV próximo?

• Proteínas: λ_max⁡ = 280 nm

• Ácidos nucleicos (AN): λ_max ⁡= 260 nm

(Nota: Los ácidos nucleicos también absorben a 280 nm, pero en menor medida que en su pico de 260 nm)

¿Cuáles son los valores estándar de los cocientes A₂₆₀/A₂₈₀​ para evaluar la pureza de muestras de ácidos nucleicos y proteínas?