UE3 Biologie Cellulaire - Méthodes d'étude des cellules et tissus

Flashcards de vocabulaire et notions clés sur le cours des méthodes d'étude en biologie cellulaire (cultures cellulaires, anticorps, immunomarquage, Western blot, immunoprécipitation et fractionnement cellulaire).

Culture cellulaire

Ensemble de techniques utilisées pour faire croître des cellules hors de leur organisme ($\text{ex-vivo}$) ou hors de leur milieu d'origine, dans des boîtes de Petri.

Dissociation du tissu d'intérêt

Première étape de l'isolement cellulaire visant à éliminer la matrice extracellulaire et les jonctions intercellulaires par voie mécanique (agitation douce) et/ou enzymatique (protéases).

Trypsine

Enzyme utilisée lors de la dissociation enzymatique des tissus pour cliver les protéines membranaires d'adhésion.

Cellules circulantes

Cellules libres (ou cellules flottantes), telles que les globules rouges ou les globules blancs, qui nécessitent une culture en suspension.

Cellules organisées en tissus

Cellules (telles que les hépatocytes ou les neurones) qui se développent en adhérant au support de culture (culture adhérente).

Culture primaire

Culture préparée directement à partir d'un tissu prélevé d'un organisme pluricellulaire, constituée de cellules se divisant un nombre limité de fois avant d'entrer en sénescence.

Sénescence cellulaire

Processus de vieillissement qui entraîne l'arrêt irréversible de la division des cellules et, finalement, leur mort.

Cellules nourricières

Cellules formant une couche sur le support de culture pour fournir une base d'accroche et échanger des nutriments avec les cellules d'intérêt (ex. cellules gliales pour la culture de neurones).

Culture secondaire

Culture obtenue après le repiquage des cellules primaires, conservant une durée de vie limitée avant d'entrer en sénescence ou d'évoluer en lignée cellulaire.

Lignée cellulaire

Population homogène de cellules « immortelles » capables de se diviser indéfiniment et d'être maintenues en culture $\text{in-vitro}$.

Cellules HeLa

Lignée cellulaire immortelle d'origine cancéreuse issue d'une biopsie de tumeur du col de l'utérus prélevée sur Henrietta Lacks.

Dérivation de la souche

Risque lié aux altérations génétiques accumulées au fil des divisions dans une lignée cellulaire, modifiant la nature des cellules et entraînant des problèmes de reproductibilité scientifique.

Anticorps (Ac)

Glycoprotéine complexe produite par des plasmocytes en réponse à une stimulation par un antigène, se liant spécifiquement à cet antigène cible.

Domaine variable ($V$)

Domaine situé à l'extrémité N-terminale de chaque chaîne légère ($V_L$) et lourde ($V_H$) d'un anticorps, responsable de la reconnaissance spécifique de l'antigène.

Domaine constant ($C$)

Domaine identique dans les anticorps d'une même espèce, comprenant 1 domaine $C_L$ sur les chaînes légères et plusieurs domaines $C_H$ sur les chaînes lourdes.

Affinité (d'un anticorps)

Grandeur reflétant la force de liaison entre un anticorps et son antigène ; plus la constante d'affinité est faible, plus l'affinité est élevée.

Sur un gradient de saccharose contenant lysosomes, mitochondries et peroxysomes, les peroxysomes sont situés plus bas et collectés avant les lysosomes, même si les trois organites provenaient initialement du même culot C2.

Vrai.
Les peroxysomes sont les plus denses, puis viennent les mitochondries et les lysosomes. Leur présence initiale dans le même culot n’implique pas une densité identique.

Un mélange polyclonal reconnaissant plusieurs épitopes d’un unique antigène est nécessairement polyspécifique.

Faux.
Il peut être qualifié de polyclonal mais monospécifique, car un seul antigène est visé.

« Toutes les lignées immortelles proviennent d’une tumeur, mais toutes les cellules tumorales ne donnent pas nécessairement une lignée. »

Faux.
La première proposition est fausse : une immortalisation peut aussi être virale ou obtenue par génie génétique.

« Chaque anticorps comporte deux chaînes lourdes et deux chaînes légères, mais chaque site de reconnaissance implique seulement une chaîne lourde. »

Faux.
Chaque site de reconnaissance comprend une partie variable de chaîne lourde et une partie variable de chaîne légère.

« En immunofluorescence indirecte, le secondaire fluorescent reconnaît préférentiellement le paratope du primaire afin d’amplifier le signal. »

Faux.
Il reconnaît les domaines constants du primaire. La fixation sur le paratope risquerait en outre de perturber sa reconnaissance de l’antigène.

Une protéine Y détectée après immunoprécipitation de X dans un lysat total prouve que X et Y appartiennent au même complexe, mais pas nécessairement qu’elles se touchent directement. »

Vrai

En immunoprécipitation, la protéine A reconnaît spécifiquement l’épitope de la protéine d’intérêt. »

Faux.
La protéine A se fixe sur l’anticorps, pas sur l’épitope de l’antigène.

« Le β-mercaptoéthanol rompt principalement les interactions hydrophobes responsables de la fixation des protéines sur la nitrocellulose. »

Faux.
Il réduit les ponts disulfure entre résidus cystéine. Les interactions hydrophobes avec la membrane interviennent plus tard.

. « Toutes les lignées immortelles proviennent d’une tumeur, mais toutes les cellules tumorales ne donnent pas nécessairement une lignée. »

Faux.
La première proposition est fausse : une immortalisation peut aussi être virale ou obtenue par génie génétique.

Quelle différence fondamentale existe entre centrifugation différentielle et centrifugation à l’équilibre sur gradient de densité ?

La centrifugation différentielle repose sur des centrifugations successives de force croissante : les éléments à coefficient de sédimentation élevé forment les premiers culots. Sur gradient, les particules migrent jusqu’à la zone dont la densité est égale à la leur et forment des bandes distinctes.

Donnez l’ordre des quatre centrifugations différentielles et le contenu principal de chaque culot.

• 800 g, 10 min → C1 : principalement les noyaux.

• 15 000 g, 10 min → C2 : mitochondries, lysosomes et peroxysomes.

• 100 000 g, 60 min → C3 : fragments de membrane plasmique et microsomes.

• 200 000 g, 3 h → C4 : ribosomes.

Le surnageant final contient la fraction soluble du cytoplasme : le cytosol.

Dans quelle situation la co-immunoprécipitation permet-elle de conclure à une interaction directe entre X et Y ?

Lorsque l’expérience est réalisée dans un système acellulaire ne contenant que les deux protéines purifiées X et Y. L’absence d’autres protéines exclut alors un intermédiaire protéique.

Comment une augmentation de la concentration en polyacrylamide modifie-t-elle la migration ?

Elle réduit la taille des pores du gel. Les mailles deviennent plus serrées et ralentissent davantage les protéines, notamment les plus grandes. Les petites protéines migrent plus facilement que les grandes.

Que risque-t-on d’observer si le β-mercaptoéthanol est omis lors de l’étude d’une protéine constituée de plusieurs chaînes reliées par des ponts disulfure ?

Les ponts disulfure peuvent rester intacts. Les chaînes liées peuvent alors migrer ensemble comme un complexe de masse apparente supérieure, au lieu d’être séparées en sous-unités polypeptidiques.

Présentez le processus complet de préparation d’une protéine avant sa séparation par SDS-PAGE.

1. Extraction des protéines pour obtenir un lysat.

2. Ajout de SDS.

3. Chauffage.

4. Dépliement et linéarisation des protéines.

5. Attribution d’une charge nette négative par le SDS.

6. Ajout généralement de β-mercaptoéthanol.

7. Réduction des ponts disulfure.

8. Dépôt sur le gel de polyacrylamide.

9. Migration des polypeptides vers l’anode positive.

Quelle différence de révélation sépare l’immunohistofluorescence de l’immunohistochimie ?

En immunofluorescence, l’anticorps de révélation porte un fluorochrome observé au microscope à fluorescence. En immunohistochimie, il porte une enzyme transformant un substrat incolore en un produit coloré insoluble, observé en lumière blanche.

Selon le cours, une constante d’affinité plus faible correspond-elle à une liaison plus faible ?

Non. Selon la convention présentée dans le cours, plus la constante est faible, plus l’affinité est élevée et plus la liaison anticorps-antigène est forte.

Comment des anticorps polyclonaux peuvent-ils être qualifiés de « monospécifiques » ?

Ils sont monospécifiques s’ils reconnaissent plusieurs épitopes appartenant à un même antigène. Ils restent polyclonaux parce qu’ils proviennent de plusieurs clones de plasmocytes et possèdent des paratopes différents.

Un anticorps monoclonal et un mélange d’anticorps polyclonaux reconnaissent le même antigène. Quelle différence fondamentale subsiste ?

Les anticorps monoclonaux proviennent d’un même clone de plasmocytes et possèdent le même paratope : ils reconnaissent un seul épitope. Les anticorps polyclonaux proviennent de plusieurs clones et peuvent reconnaître plusieurs épitopes.

De quoi est constitué le site de fixation d’un antigène sur un anticorps ?

Il comporte les domaines variables d’une chaîne lourde et d’une chaîne légère. Le site de l’anticorps qui reconnaît l’antigène est le paratope, tandis que la région correspondante de l’antigène est l’épitope.

Associez chaque objectif à la technique la plus adaptée : localiser une protéine, rechercher son expression, rechercher ses partenaires.

• Localiser une protéine : immunomarquage.

• Rechercher son expression : Western blot.

• Rechercher ses partenaires : co-immunoprécipitation, suivie d’un Western blot.

Un Western blot seul ne conserve pas la localisation tissulaire de la protéine

Pourquoi une lignée cellulaire facile à cultiver ne constitue-t-elle pas forcément le meilleur modèle biologique ?

Une lignée se divise indéfiniment et s’adapte aux conditions artificielles, mais elle peut subir une dérive due à l’accumulation d’altérations génétiques. Elle peut alors ne plus reproduire fidèlement les propriétés des cellules initiales et donner des résultats différents selon les laboratoires.

Présentez les trois origines possibles de l’immortalité d’une lignée cellulaire.

• Origine cancéreuse : par exemple les cellules HeLa.

• Contamination virale naturelle ou provoquée : par exemple par un virus du groupe herpès ou par SV40.

• Modification génétique : par exemple introduction du gène T de SV40.

L’immortalité ne signifie donc pas systématiquement que la cellule initiale était cancéreuse.

Une culture primaire est repiquée une première fois. Comment nomme-t-on la culture obtenue et devient-elle immortelle ?

Elle devient une culture secondaire, mais elle n’est pas nécessairement immortelle. Les cellules peuvent continuer à se diviser pendant un temps limité avant d’entrer en sénescence. Seules certaines cultures secondaires peuvent évoluer en lignées cellulaires.

. Quel est le rôle précis de la trypsine lors de la préparation d’une culture cellulaire primaire ?

La trypsine est une protéase utilisée pour cliver des protéines membranaires d’adhésion. Elle facilite donc la séparation des cellules entre elles et vis-à-vis de la matrice. Elle ne sélectionne pas spécifiquement le type cellulaire recherché.

Des neurones sont placés dans un milieu liquide contenant tous les nutriments nécessaires, mais ils ne survivent pas. Quelle condition a pu être oubliée ?

Les neurones sont normalement des cellules organisées en tissu et se cultivent généralement en culture adhérente. Ils peuvent nécessiter un support adapté, voire une couche de cellules nourricières gliales, comme des astrocytes ou des oligodendrocytes.

Épitope

Également appelé déterminant antigénique, c'est la partie spécifique d'un antigène reconnue par un anticorps qui déclenche la réponse immunitaire.

Paratope

Site de liaison situé sur l'anticorps qui interagit directement avec l'épitope de l'antigène pour former le complexe anticorps-antigène.

Anticorps monoclonaux

Anticorps issus d'un seul clone de plasmocytes, possédant tous exactement le même paratope et dirigés contre un seul épitope spécifique.

Anticorps polyclonaux

Mélange d'anticorps produits par plusieurs clones distincts de plasmocytes, capables de reconnaître plusieurs épitopes.

Immunomarquage

Méthode permettant de détecter la localisation de protéines ou d'autres antigènes $\text{in-situ}$ sur des coupes de tissu à l'aide d'anticorps marqués.

Immunohistofluorescence (IHF)

Technique d'immunomarquage utilisant un fluorochrome (ex. FITC, phycoérythrine) couplé aux anticorps et observée en microscopie UV avec un fond généralement sombre ou noir.

Immunohistochimie (IHC)

Technique d'immunomarquage où l'anticorps est couplé à une enzyme convertissant un substrat incolore en un produit coloré insoluble, observée au microscope optique standard sur fond blanc ou clair.

Western blot (WB)

Technique analytique (également appelée immuno-empreinte ou immunoblotting) permettant de détecter spécifiquement l'expression d'une protéine.

SDS (DodécylSulfate de Sodium)

Détergent anionique qui déplie et linéarise les protéines, empêche leur repliement et leur confère une charge nette négative proportionnelle à leur taille.

\beta-mercaptoéthanol

Agent réducteur utilisé pour casser les ponts disulfures entre chaînes latérales de cystéine lors de la dénaturation des protéines.

Saturation (de la membrane de nitrocellulose)

Étape du Western blot consistant à bloquer les sites libres de la membrane avec une solution concentrée de protéines (ex. lait ou BSA) afin d'éviter les liaisons non spécifiques d'anticorps.

Immunoprécipitation (IP)

Technique servant à isoler et purifier une protéine d'intérêt au sein d'un mélange à l'aide d'un anticorps spécifique et d'un ligand coprécipitant (ex. protéine A).

Co-immunoprécipitation (co-IP)

Extension de l'immunoprécipitation permettant d'isoler une protéine d'intérêt avec les partenaires protéiques qui lui sont physiquement associés pour étudier les interactions protéine-protéine.

Fractionnement cellulaire

Ensemble de techniques reposant sur les différences de densité et de taille des organites cellulaires pour les séparer et les isoler après lyse cellulaire.

Coefficient de sédimentation

Grandeur exprimée en Svedberg ($S$) indiquant la vitesse à laquelle une particule sédimente sous l'action d'une force centrifuge.

Centrifugation différentielle

Méthode de séparation basée sur une succession de centrifugations à vitesses et durées croissantes pour isoler successivement les composants cellulaires dans les culots.

Centrifugation à l'équilibre sur gradient de densité

Méthode où les constituants cellulaires migrent dans un gradient de densité (ex. saccharose) jusqu'à atteindre une position où la densité du milieu est égale à la leur.