Molekularbiologie: Grundlegende DNA-Methoden

Flashcards zur Wiederholung der Grundlagen der Molekularbiologie, DNA-Eigenschaften, Klonierungsmethoden und Selektionsverfahren.

Funktion der DNA in der Zelle

Die DNA dient als Speicher der genetischen Information in der Zelle.

Zucker-Unterschied zwischen DNA und RNA

Der Unterschied liegt an der $2'$ ($C_2$)-Position des Zuckers: RNA besitzt dort eine Hydroxylgruppe ($\text{OH}$), während DNA an dieser Stelle nur einen Wasserstoff ($\text{H}$) aufweist.

Wasserstoffbrückenbindungen (G-C vs. A-T)

Ein G-C-Paar bildet $3$ Wasserstoffbrückenbindungen aus und ist thermodynamisch stabiler als ein A-T-Paar mit $2$ Wasserstoffbrückenbindungen. Sequenzen mit hohem G-C-Gehalt benötigen mehr Energie bzw. höhere Temperaturen zur Strangtrennung.

Ladung von Phosphatgruppen

Phosphatgruppen der Nukleinsäuren sind in einem weiten pH-Bereich negativ geladen und wasserlöslich.

Chemische Eigenschaften von Zucker und Basen

Die Zuckerbausteine von Nukleinsäuren sind ungeladen und wasserlöslich, während die Stickstoffbasen lipophil bzw. hydrophob sind.

PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese)

Ein Elektrophoreseverfahren zur Trennung und Analyse von kurzen Nukleinsäuren im Bereich von $20$ bis $500$\,\text{bp}.

Agarose-Gelelektrophorese

Eine Standardmethode zur Auftrennung und Größenbestimmung von Nukleinsäuren im Bereich von $300$ bis $30.000$\,\text{bp}.

Antiparallelität der DNA-Stränge

Die beiden zueinander komplementären Einzelstränge eines DNA-Doppelstrangs verlaufen in entgegengesetzter Orientierung ($5' \rightarrow 3'$ und $3' \rightarrow 5'$).

Funktion eines Reaktionspuffers

Ein Puffer gewährleistet optimale Reaktionsbedingungen (wie den passenden pH-Wert) für die Aktivität des eingesetzten Enzyms.

UV-Licht-Einfluss auf Agarosegele

Die Bestrahlung mit UV-Licht kann Mutationen in der DNA induzieren, was das spätere Klonieren der DNA-Fragmente erschwert.

Laufverhalten von DNA im Gel-Marker-Vergleich

Standard-DNA-Längenmarker beziehen sich stets auf lineare DNA; lediglich lineare DNA-Fragmente wandern exakt entsprechend der vom Marker angegebenen Größe.

Replikon

Ein DNA-Abschnitt, der den Replikationsursprung (Ori) sowie die zugehörigen Kontrollelemente umfasst und somit für die eigenständige Replikation der DNA essentiell ist.

Selektionsmarker

Ein Gen auf einem Plasmid (z. B. ein Ampicillin-Resistenzgen), das es ermöglicht, Zellen nach einer Transformation zu identifizieren, die das Plasmid erfolgreich aufgenommen haben.

Multiple Cloning Site (MCS)

Ein synthetischer DNA-Bereich in einem Vektor, der viele verschiedene Schnittstellen für Restriktionsenzyme enthält, die jeweils nur ein einziges Mal im gesamten Vektor vorkommen.

Plasmid-Voraussetzung für die Blau-Weiß-Selektion

Das Plasmid muss für das $\alpha$-Fragment der $\beta$-Galaktosidase ($lacZ'$) codieren, und die Multiple Cloning Site (MCS) muss innerhalb dieses Gens liegen.

Wirtsstamm-Voraussetzung für die Blau-Weiß-Selektion

Der verwendete E. coli-Stamm muss das $\omega$-Fragment der $\beta$-Galaktosidase auf dem Chromosom codieren (Genotyp $lacZ\Delta M15$), um eine $\alpha$-Komplementation zu ermöglichen.

$\alpha$-Komplementation

Die Wiederherstellung einer aktiven $\beta$-Galaktosidase durch den Zusammenschluss des auf dem Vektor codierten $\alpha$-Fragments und des im Bakteriengenom codierten $\omega$-Fragments.

Fehlerquelle bei der Blau-Weiß-Selektion durch kleine Inserts

Sehr kurze Inserts (z. B. $210$\,\text{bp}$), deren Länge ein Vielfaches von 3 ist, erzeugen keinen Rasterschub. Dadurch kann trotz erfolgreicher Klonierung ein funktionelles$\alpha$$-Peptid entstehen und fälschlicherweise eine blaue Kolonie gebildet werden.

Dephosphorylierung von Vektoren

Die enzymatische Abspaltung der $5'$ Phosphatgruppen an geschnittenen Vektorenden durch eine Phosphatase zur Verhinderung der Vektor-Religation bei Einzelverdauen.

5'-Phosphorylierung von PCR-Primern

Erforderliche Modifikation bei der Klonierung von stumpfendigen PCR-Produkten in einen dephosphorylierten Vektor, da kommerzielle Primer standardmäßig nur mit $5'-\text{OH}$-Gruppen geliefert werden.

Sticky-End- vs. Blunt-End-Ligation

Ligationen mit kompatiblen überstehenden Enden (Sticky Ends) sind wesentlich effizienter als Blunt-End-Ligationen, da die komplementäre Basenpaarung die Interaktion der Fragmente vorübergehend stabilisiert.

Shuttle-Vektor

Ein Plasmidsystem, das in zwei unterschiedlichen Organismenarten (z. B. E. coli und Haloferax volcanii) replizieren kann und dafür zwei Replikationsursprünge (Origins) sowie zwei Selektionsmarker besitzt.

Sicherheitsmerkmale von E. coli-Laborstämmen

Molekularbiologische E. coli-Laborstämme sind nicht pathogen und tragen Defektmutationen, die ein Überleben außerhalb der kontrollierten Laborumgebung verhindern.

Replikation

Der biologische Prozess der exakten Vervielfältigung bzw. Verdopplung der DNA.

Transkription

Der Syntheseprozess einer RNA-Molekülkette (mRNA oder non-coding RNA) anhand eines DNA-Einzelstrangs als Matrize.

Translation

Die Synthese einer Polypeptidkette (Protein) an den Ribosomen auf der Grundlage der genetischen Information einer mRNA.

Southern Blot

Eine molekularbiologische Nachweismethode zur gezielten Identifizierung spezifischer DNA-Sequenzen im Genom eines Organismus.

Ur-Eukaryoten-Zelle

Die evolutionäre Vorläuferzelle der Eukaryoten, bei der es sich um eine archaeale Zelle – sehr wahrscheinlich ein Asgard-Archaeon – handelte.