LFL311 DNA isolatie

DNA workflow

sampling - extractie - kwantificatie - amplificatie - scheiding en detectie - data-analyse - rapportage

verschillende DNA isolatie methoden

chelex, fenol-chloroform, FTA papier, solid phase extraction, geautomatiseerd, prepGEM, opties voor specifieke gevallen

chelex - isolatie methode

de klassieke methode - voordelen zijn simpel, snel, goedkoop en weinig disposables - nadeel is PCR inhibitie

fenol-chloroform - isolatie methode

organische extractie - voordelen zijn niet gefragmenteerd DNA, zuiver, goedkoop - nadelen zijn veel werk en toxische vloeistoffen

FTA papier - isolatie methode

voordeel is erg stabiel DNA - nadeel is statische elektriciteit

solid phase extraction - isolatie methode

de meeste kits - meerdere protocollen voor verschillende sample types - o.b.v. silica adsorption - meerdere wasstappen is zowel voordeel als nadeel

geautomatiseerd - isolatie methode

magnetic beads - ongeveer hetzelfde principe als SPE - magneet trekt beads naar de zijkant waardoor er minder DNA verlies is

prepGEM - isolatie methode

thermofilische proteinase - voordeel is in een enkel epje - nadeel is geen wasstappen

andere opties voor isolatie methoden voor specifieke gevallen

differentiaal, direct PCR

wat is belangrijk voor DNA isolatie?

hoeveelheid, zuiverheid, vaardig en goed opgeleid personeel, fysisch-chemisch sample type, tijd benodigd voor isolatie, kosten, mogelijkheden automatisering, beschikbare apparatuur

DNA isolatie wordt over het algemeen opgedeeld in 4 stappen:

verstoring van het celmembraan, cellyse - denaturatie van proteïnen (soms ook deels precipitatie) - DNA scheiding van gedenatureerde proteïnen en andere cellulaire componenten/wasstappen - elutie van het DNA

werking van SPE

lyseren m.b.v. proteinase K en buffer, breken membraan en proteïnen als DNAse - DNA denatureren m.b.v. temperatuur - nucleïnezuur adsorbeert aan silica korrels in de aanwezigheid van hoge concentraties chaotrope zouten en een neutrale of zure pH - door het toevoegen van buffer en het centrifugeren worden onzuiverheden weggewassen - door het toevoegen van een meer basische buffer zonder zout laat het DNA weer los en kan het ge-elueerd worden

wat doet een chaotroop zout

het verstoort waterstofbruggen in waterige oplossing waardoor gedenatureerd DNA meer thermostabiel is dan wanneer het gevouwen is. het zorgt er dus voor dat het DNA kan binden aan de silica

de werking van prepGEM

er is geen concentratiestap dus DNA kwantiteit hangt af van: kwaliteit oorspronkelijk sample + type swab en volume van water gebruikt om swab te wassen + extractie volume

wat zijn ‘moeilijke samples’ voor DNA isolatie

sperme, haar, botten en tanden

DNA isolatie uit sperma en haar

disulfide bruggen beschermen de chromatine waardoor DNA extractie lastig is - door DTT toe te voegen aan de extractie worden de S-S bruggen afgebroken en kan er alsnog geëxtraheerd worden

DNA isolatie uit botten en tanden

bestaan mede uit hydroxy-apatiet - DNA heeft een hoge affiniteit met hydroxy-apatiet - door het sample te verpulveren en te ontkalken is DNA extractie alsnog mogelijk

DNA isolatie - differentiaal

methode die wordt gebruikt bij zedenzaken waar zowel sperma als vrouwelijke epitheel cellen aanwezig kunnen zijn - spermacellen worden alleen gelyseerd bij aanwezigheid van DTT dus kan relatief makkelijk het vrouwelijk van het mannelijk DNA worden gescheiden - voorkomt mogelijk het analyseren van lastige mengprofielen