5단원 정리 - Fundamental Molecular Genetic Mechanisms

DNA —> RNA —> Protein 각 step을 뭐라고 부르나 3

(central dogma of molecular biology)

Replication: DNA —> DNA

Transcription: DNA —> RNA

Translation: RNA —> Protein

Q. DNA nucleotide의 구성요소는?

• 5-carbon sugar

• Nitrogenous base

• Phosphate

DNA sequence는 _____ 방향으로 표현한다.

5’ —> 3’

Nucleotide들이 ______linkage로 연결되어____ backbone을 형성한다. (공통)

phosphodiester

B-DNA의 특징을 설명하시오 5

• 세포에서 가장 흔한 DNA 형태이며 right-handed double helix이다.

• 두 가닥은 antiparallel하게 배열된다.

• Watson-Crick base pairing: A=T, G≡C

• 약 10~10.5 bp/turn, 지름 약 23 Å

• Major groove를 통해 단백질이 염기서열을 인식할 수 있다.

Major groove의 중요성

Major groove는 상대적으로 넓고, DNA 염기들의 화학적 특징이 노출되어 있다.
따라서 단백질이 DNA를 풀지 않고도 염기서열을 인식하고 특정 sequence에 결합할 수 있다

A-DNA

1. 형태

2. 방향

3. bp/turn

4. 지름

5. 대표적 상황

1. 짧고 눌린형태

2. right-handed

3. 약 11

4. 23Å

5. RNA, dehydration/hight salt

B-DNA

1. 형태

2. 방향

3. bp/turn

4. 지름

5. 대표적 상황

1. 일반적인 원통형

2. right handed

3. 약 10~10.5

4. 약 20A

5. 가장 흔한 DNA

Z-DNA의 특징은?

• Left-handed DNA

• 길고 얇은 형태, 약 18 Å

• GC-rich / alternating purine-pyrimidine sequence에서 형성되기 쉽다.

• DNA methylation이나 superhelical density 증가와 관련되어 B→Z transition이 일어날 수 있다.

• Z-DNA-specific binding protein이 존재한다.

Q. TBP는 DNA에 어떻게 결합하고 어떤 영향을 주는가?

• AT-rich TATA sequence에 결합한다.

• DNA의 minor groove 쪽으로 결합한다.

• DNA double helix를 untwist하고 sharply bend시킨다.

• 이를 통해 transcription activation에 기여한다.

Hyperchromicity란?

DNA가 double-stranded → single-stranded로 denaturation될 때 DNA의 260 nm UV absorbance가 증가하는 현상이다.

Q. Tm(melting temperature)이란?

DNA melting curve에서 DNA의 약 50%가 single strand로 분리되는 온도이다.

Q. DNA의 Tm을 증가시키는 요인은? 2

• GC content ↑

• Salt/cation ↑ → phosphate 간 반발력 감소

Q. DNA의 Tm을 감소시키는 요인은? 2

• 극단적인 pH

• Formamide

• Urea

==> H bond breaker

Q. Denaturation과 renaturation의 차이는?

• Denaturation: dsDNA → 두 ssDNA로 분리

• Renaturation: 분리된 ssDNA가 상보적인 서열을 찾아 다시 dsDNA 형성

DNA replication이나 transcription 중 supercoiling이 생기는 이유는?

Helicase 등이 DNA double strand를 풀면 진행 방향 앞쪽에 torsional stress가 발생한다.
이 stress를 해소하지 못하면 DNA에 supercoiling이 형성되어 DNA-related protein의 진행을 방해한다.

Topoisomerase 기능과

종류 차이 설명I vs II

• Topoisomerase: DNA의 torsional stress와 supercoiling을 해소한다.

• Type I: DNA의 한 가닥을 절단한 후 다시 연결한다.

• Type II: DNA의 두 가닥을 절단한 후 다시 연결한다.

• Topoisomerase I inhibitor로 camptothecin, irinotecan 등이 항암제로 사용된다

Q. DNA polymerase의 합성 방향과 primer가 필요한 이유는?

DNA polymerase는 5′→3′ 방향으로만 DNA를 합성하며, 기존 nucleotide의 3′-OH에 새로운 nucleotide를 첨가한다.
따라서 DNA synthesis를 시작하기 위해서는 이미 존재하는 3′-OH를 제공하는 primer가 필요하다.
Eukaryotic DNA replication에서는 주로 RNA primer가 사용된다.

DNA polymerase가 가지는 주요 activity는? 3

• 5′→3′ DNA synthesis

• 3′→5′ exonuclease → proofreading

• 5′→3′ exonuclease → RNA primer removal

DNA replication에 관여하는 단백질 8 - list만

1. helicase

2. primase

3. DNA polymerase

4. Topoisomerase

5. Sliding Clamp (PCNA)

6. Clamp loader

7. RPA

8. DNA ligase

1. helicase

2. primase

3. DNA polymerase

4. Topoisomerase

역할설명

• Helicase: ATP를 이용해 replication fork 앞에서 DNA double strand의 base pairing을 풀어준다 ==> unwind double helix

• Primase: template DNA를 이용해 RNA primer를 합성한다.

• DNA polymerase: primer의 3′-OH에서 시작하여 5′→3′ 방향으로 complementary DNA를 합성한다.

• Topoisomerase: Helicase에 의해 발생하는 torsional stress와 supercoil을 해소한다.

1. Sliding Clamp (PCNA)

2. Clamp loader

3. RPA

4. DNA ligase

역할설명

• Sliding clamp(PCNA): DNA polymerase가 template에서 떨어지지 않도록 잡아 processivity를 증가시킨다.

• Clamp loader(RFC): PCNA를 DNA의 필요한 위치에 loading한다.

• RPA: 노출된 ssDNA에 결합하여 재결합을 방지하고 template을 single-stranded 상태로 유지한다.

• DNA ligase: DNA의 phosphate backbone을 연결하여 Okazaki fragments 사이의 nick을 봉합한다.

Q. Leading strand와 lagging strand의 차이는?

• DNA polymerase는 항상 5′→3′로 합성하기 때문에 두 가닥의 합성 방식이 다르다.

• Leading strand: replication fork 진행 방향과 같은 방향으로 연속적 합성

• Lagging strand: fork 진행 방향과 반대 방향으로 불연속적 합성

• Lagging strand에서는 여러 RNA primer가 필요하며 Okazaki fragments가 형성된다.

• 이후 DNA ligase가 fragment들을 연결한다

Replication origin 의미 + 특징 2

• Replication origin: parental DNA가 풀리기 시작하는 복제 시작점.

• 일반적으로 AT-rich sequence를 가진다.

Replication fork이란? 2

• Replication fork: DNA가 실제로 unwinding되고 daughter strand가 합성되는 부위.

• 하나의 origin에서 양방향으로 replication fork가 형성되어 bidirectional replication이 일어난다.

Pol ε와 Pol δ의 역할은?

• Pol ε: leading strand DNA synthesis

• Pol δ: lagging strand DNA synthesis

• Pol δ는 PCNA-dependent하게 작용한다.

DNA damage의 원인은? 3-5

• DNA replication 과정의 copying error

• spontaneous chemical changes

• UV

• X-ray / ionizing radiation

• carcinogens

• ROS

DNA repair에 이상이 생기면 mutation이 축적되어 ___와 관련될 수 있다.

cancer

Cytosine deamination이 mutation을 유발하는 이유는?

• Cytosine의 deamination → Uracil(U)

• U는 정상적인 DNA base가 아니므로 repair system이 쉽게 인식한다.

• 반면 5-methylcytosine → deamination → Thymine(T)

• T는 정상 DNA base이므로 repair가 어려워 mutation으로 남을 수 있다.

Base excision repair의 원인

비정상적인 하나의 base 또는 T-G mismatch와 같은 작은 base damage.

Base Excision Repair 과정 4

1. DNA glycosylase가 glycosidic bond를 끊어 손상된 base만 제거 → AP site 형성

2. APE1 endonuclease가 AP site의 backbone을 절단

3. AP lyase가 남은 damaged backbone을 제거

4. DNA polymerase β가 올바른 nucleotide를 넣고 DNA ligase가 연결한다

Mismatch excision repair의 원인

DNA replication 중 발생한 single-base mismatch 또는 작은 insertion/deletion.

Mismatch Repair 과정 4

1. MSH2/MSH6가 mismatch를 인식

2. MLH1/PMS2가 recruitment되어 daughter strand를 절단

3. Helicase + exonuclease가 mismatch를 포함한 일부 DNA를 제거

4. DNA polymerase δ가 빈 부분을 채우고 DNA ligase가 연결한다.

Base excision

1. 주요문제

2. 제거

3. 시작 단백질

4. 대표 Pol

1. damaged base/ T-G mismatch

2. base하나부터

3. DNA glycosylase

4. Pol β

Mismatch Repair

1. 주요문제

2. 제거

3. 시작 단백질

4. 대표 Pol

1. replication error

2. mismatch 포함 DNA segment

3. MSH2/MSH6

4. Pol δ

Nucleotide excision repair가 필요한 대표적인 DNA damage와 과정을 설명하시오.

• 대표적인 손상은 UV에 의해 생기는 thymine-thymine dimer이다.

• TT dimer는 DNA 구조에 distortion/kink를 만들고 replication/transcription을 방해한다.

• Nucleotide excision repair는 손상된 부분을 포함한 DNA segment 전체를 제거한다.

• 이후 DNA polymerase가 빈 부분을 채우고 ligase가 연결한다.

• NER defect는 xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome과 관련된다.

Nonhomologous end joining의 과정과 문제점은?

• DNA double-strand break를 복구하는 방법이다.

• DNA-PK–KU70/KU80 complex가 끊어진 DNA ends를 인식한다.

• Nuclease가 일부 nucleotide를 제거한 뒤 DNA ligase가 양 끝을 직접 연결한다.

• 빠르지만 접합 과정에서 DNA가 소실될 수 있어 deletion, translocation, inversion, circularization 등의 mutation이 발생할 수 있다.

Q. Homologous recombination을 이용한 DNA double-strand break repair의 핵심은?

상동적인 정상 DNA를 template으로 이용하여 손상된 DNA를 복구한다.
DNA strand가 상동 DNA로 strand invasion을 하고, Holliday junction과 crossover 구조를 거쳐 정확한 서열을 복구한다.

Transcription의 방향과 3단계는?

RNA는 5′→3′ 방향으로 합성된다.

1. Initiation

2. Elongation

3. Termination

Transcription 중 DNA가 부분적으로 풀려 _____을 형성한다.

transcription bubble

RNA polymerase는 어느 DNA strand를 template으로 사용하는가?

RNA polymerase는 template strand를 읽으며 RNA를 합성한다.
RNA sequence는 template strand와 complementary하며, coding strand와는 T 대신 U를 가진 동일한 sequence를 갖는다.

TATA box란?

• Eukaryotic RNA polymerase II promoter와 관련된 AT-rich sequence

• 일반적으로 transcription start site의 약 26–31 bp upstream

• 전사가 활발한 gene에서 발견된다.

• TBP가 결합하여 DNA를 bend시킨다.

5′ capping의 구조, 시기와 기능을 설명하시오.

• 전사 중 새로 합성되는 pre-mRNA의 5′ end에 형성된다.

• 첫 nucleotide에 7-methylguanosine(m⁷G)이 붙는다.

• 일반적인 3′→5′ linkage가 아닌 5′→5′ triphosphate linkage를 가진다.

• mRNA degradation을 방지하고 nuclear export와 translation initiation에 중요하다.

Eukaryotic pre-mRNA가 mature mRNA가 되기 위해 거치는 processing은?

• 5′ capping

• 3′ poly-A tail addition

• Splicing

Alternative splicing이란?

하나의 pre-mRNA에서 서로 다른 exon 조합을 선택하여 splicing함으로써 하나의 gene으로부터 여러 종류의 mRNA와 protein을 생성하는 과정이다.

👉 gene 수보다 protein diversity가 큰 이유

Q. Codon과 anticodon을 설명하시오.

• Codon: mRNA의 3개 nucleotide로 이루어진 triplet genetic code이며 특정 amino acid 또는 stop signal을 지정한다.

• Anticodon: tRNA에 존재하는 3개 nucleotide로 codon과 complementary하게 결합한다.

• 총 64 codons = 61 amino-acid codons + 3 stop codons이다.

Start codon

• AUG

• 일부 상황에서 GUG, CUG도 start codon으로 작용 가능

• start codon으로 사용될 경우 Methionine 지정

Stop codon 3

• UAA

• UGA

• UAG

Synonymous, missense, nonsense, frameshift mutation을 비교하시오.

• Synonymous: nucleotide가 바뀌지만 amino acid가 변하지 않음.

• Missense: nucleotide 변화 → 다른 amino acid으로 바뀜.

• Nonsense: nucleotide 변화 → stop codon 생성 → translation 조기 종결

• Frameshift: nucleotide의 insertion/deletion으로 reading frame이 바뀌어 이후 amino acid sequence가 크게 변화하거나 조기종결.

Q. Wobble이란 무엇이며 왜 중요한가?

• mRNA codon의 3번째 nucleotide와 tRNA anticodon의 첫 번째 nucleotide 사이에서 나타나는 nonstandard base pairing이다.

• 정확한 Watson-Crick pairing이 아니어도 pairing이 가능하다.

• 대표적으로 inosine은 C/A/U와 pairing할 수 있다.

• 따라서 tRNA 수가 codon 수보다 적어도 61개의 amino-acid codon을 모두 읽을 수 있다.

Q. tRNA의 주요 특징을 설명하시오. 4-5

• 약 70–80 nt

• 여러 stem과 loop로 접힌 L-shaped structure

• chemical modification: inosine, dihydrouridine, pseudouridine

• 3′ end에 CCA가 존재

• 3′-CCA에 amino acid가 결합한다.

Amino acid activation by aminoacyl-tRNA synthetase를 설명하시오.3

1. Aminoacyl-tRNA synthetase는 적절한 amino acid와 tRNA를 인식하여 amino acid를 tRNA의 3′-CCA에 연결한다.

2. 효소에는 amino acid pocket과 tRNA-binding site가 있으며 tRNA의 특이적 구조를 인식한다.

3. 이 과정에서 ATP hydrolysis가 사용되고, high-energy ester bond가 형성되어 translation을 위한 aminoacyl-tRNA가 만들어진다.

Q. Ribosome의 주요 구성과 기능은?

• Ribosome = rRNA + protein

• rRNA가 핵심적인 catalytic role을 담당한다.

• Polypeptide chain의 peptide bond 형성에 관여한다.

• Ribosome은 small subunit + large subunit으로 구성된다.

Eukaryotic translation initiation 과정을 설명하시오. 5

1. eIF1/eIF1A가 small ribosomal subunit에 결합하고, eIF2-GTP–Met-tRNA가 P site에 위치한다.

2. eIF4E가 mRNA의 5′ cap, eIF4G가 poly-A tail과 결합하여 mRNA를 준비한다.

3. small subunit이 5′→3′ 방향으로 scanning하여 AUG를 찾는다.

4. AUG가 인식되면 eIF2-GTP hydrolysis가 일어나고 start codon–anticodon pairing이 안정화된다.

5. large subunit이 결합하고 initiation factors가 제거되어 translation이 시작된다. 약술 자료 (5-7장)

Ribosome의 A, P, E site의 기능은?

• A site (Aminoacyl): 새 aminoacyl-tRNA가 들어오는 자리

• P site (Peptidyl): growing peptide를 가진 tRNA가 위치

• E site (Exit): amino acid를 전달한 deacylated tRNA가 나가는 자리

Q. Translation elongation에서 EF1과 EF2의 역할은?

• EF1: aminoacyl-tRNA를 A site로 가져오고 codon-anticodon pairing을 확인한다.

• 적절한 tRNA가 들어오면 GTP hydrolysis로 conformational change를 유도한다.

• EF2: ribosome translocation을 유도하여 다음 codon이 A site에 오도록 한다.

Q. Translation termination의 과정을 설명하시오.

• Stop codon에는 대응하는 tRNA가 존재하지 않는다.

• 대신 release factor(eRF1)가 A site에 결합한다.

• eRF1이 stop codon을 인식하고 peptidyl-tRNA bond cleavage를 촉진한다.

• eRF3-GTP가 termination을 돕고 완성된 polypeptide가 release된다.

• 이후 ribosomal complex가 해체된다.

Q. Polysome이란?

하나의 mRNA에 여러 ribosome이 동시에 결합하여 translation을 수행하는 구조이다.
여러 ribosome이 동시에 하나의 mRNA를 번역하기 때문에 translation efficiency를 증가시키며, ribosome recycling과 함께 작용한다.

Positive-sens ssRNA virus

1. genome 자체가 mRNA 역할

2. 감염 후 translation

3. 필요한것

4. 기본 흐름

1. O

2. 바로 가능

3. host ribosome

4. + —> - —> +

Negative-sense ssRNA virus

1. genome 자체가 mRNA 역할

2. 감염 후 translation

3. 필요한것

4. 기본 흐름

1. X

2. 바로 불가능

3. RdRP

4. - —> + —> -

Reverse transcriptase의 기능을 설명하시오.

1. Reverse transcriptase는 RNA를 template으로 DNA를 합성하는 RNA-dependent DNA polymerase이다.

2. Retrovirus 감염 시 viral (+)ssRNA를 template으로 cDNA를 만들고, 이후 dsDNA를 형성하여 host genome에 삽입될 수 있게 한다.

3. 또한 RNase H 및 DNA polymerase activity도 가진다.

HIV retrovirus의 lifecyce 설명하시오.

HIV는 ssRNA genome과 reverse transcriptase, tRNA, integrase 등을 가지고 host cell에 감염된다.
① viral RNA → reverse transcriptase에 의해 dsDNA 형성
② integrase에 의해 host genome에 삽입 → provirus
③ host RNA polymerase가 provirus를 전사
④ viral RNA가 cytosol로 이동하여 viral protein을 합성
⑤ viral components가 조립되어 세포 밖으로 방출된다.

Rev protein의 역할 설명

HIV의 충분히 splicing되지 않은 viral mRNA가 host nuclear quality control에 걸리지 않고 nucleus → cytosol로 이동하도록 한다.

Rev는 RRE(Rev-responsive element)에 결합하여 이 RNA의 export를 촉진한다.

Xist란?

X염색체 불활성화에 관여하는 non-coding RNA이다.

DNA vs RNA 2

1. DNA has higher chemical stability = better for long term genetic information storage

2. DNA sugar has no 2’- OH, while RNA sugar does.