KOLOS SEMKI 1,2,3 - terapie genowe BAZA

Które elementy są niezbędne do działania systemu CRISPR-Cas9?

Nukleaza Cas9, RNA kierujące oraz odpowiednia sekwencja PAM

Jaką funkcję pełni RNA kierujące w systemie CRISPR-Cas9?

Rozpoznaje sekwencje docelową DNA i kieruje do niej Cas9

Do metod fizycznych wprowadzenia informacji genetycznej do komórek in vitro zalicza się:

ultradźwięki, gdzie zjawisko kawitacji powoduje przejściowe naruszenie ciągłości i wzrost przepuszczalności błony cytoplazmatycznej, umożliwiając wnikanie cząsteczek plazmidowego DNA

Co nie jest cechą obcego wektora?

toksyczny dla komórek gospodarza

Szok cieplny jako metoda wprowadzania informacji genetycznej do komórek in vitro wykorzystuje:

jony Ca2+ i działanie niskiej temperatury

Uzupełnianka

Systemy TALEN i ZFN należą do metod edycji genomu wykorzystujących nukleazę ____FokI______, która powoduje przecięcie obu nici DNA. W systemie TALEN każda jednostka rozpoznająca DNA odpowiada za rozpoznanie ____Jednego______ nukleotydu, natomiast w systemie ZFN pojedynczy motyw palca cynkowego rozpoznaje zazwyczaj sekwencję złożoną z _____3-4_____ nukleotydów.

Klucz odpowiedzi: FokI, jednego, 3-4

Co dzieje się z materiałem genetycznym podczas transfekcji przejściowej?

DNA może pozostawać w formie episomalnej, umożliwiając czasową ekspresję transgenu, a jego ilość może zmniejszać się podczas podziałów komórkowych.

Który z poniższych zestawów zawiera cechy, które NIE są pożądane u dobrego wektora w terapii genowej?

Toksyczność dla komórek i niska wydajność w transfekcji

Która metoda modyfikacji ekspresji genu prowadzi do zmniejszenia poziomu mRNA lub białka bez wprowadzania zmian w sekwencji DNA genomu?

Knock-down

Który z wymienionych lipidów kationowych, będący monokationową cząsteczką opartą na czwartorzędowej soli amoniowej, wchodzi w skład Lipofektyny?

DOTMA

Dendrymery to cząsteczki wykorzystywane w transferze materiału genetycznego i farmakoterapii, definiowane jako:

rozgałęzione struktury zawierające specjalne, charakterystyczne grupy funkcyjne zdolne do wiązania substancji (np. leków lub kwasów nukleinowych)

W wektorze ekspresyjnym obecność sekwencji IRES (Internal Ribosome Entry Site) umożliwia

Translację drugiego genu w plazmidzie policistronowym w sposób niezależny od czapeczki 5'

Co oznacza tropizm wektora wirusowego?

Preferencję zakażenia określonych komórek lub tkanek

W którym cyklu namnażania wirusa, jego namnożenie powoduje rozpad komórki?

cykl lityczny

Która z poniższych cech charakteryzuje adenowirusy wykorzystywane jako wektory do przenoszenia materiału genetycznego do komórek?

Ich materiałem genetycznym jest dwuniciowe DNA, a materiał genetyczny wektora zazwyczaj nie integruje się z genomem komórki gospodarza.

Co jest charakterystyczną cechą wirusów AAV?

wykazują stałą ekspresję episomalną lub integrują się w stałym miejscu na chromosomie 19.

Która z poniższych cech najlepiej opisuje wektory adenowirusowe wykorzystywane w terapii genowej?

Mogą transdukować komórki dzielące się i niedzielące, a ich genom zazwyczaj pozostaje w formie episomalnej.

Jaki materiał genetyczny mają wirusy AAV?

Jednoniciowe DNA

Które regiony genomu usunięto w wektorach adenowirusowych pierwszej generacji?

E1 i E3

Wektory trzeciej generacji cechują się największą pojemnością upakowania, ponieważ:

usunięto niemal wszystkie sekwencje wirusowe, zachowując jedynie te niezbędne do replikacji DNA i upakowania wirusa.

Jaki element sekwencji loxP odpowiada bezpośrednio za nadanie jej kierunkowości (orientacji), determinując rodzaj rekombinacji (delecja vs. inwersja)?

Asymetryczny region centralny (rdzeniowy) o długości 8 pz

Ile cząsteczek rekombinazy Cre wchodzi w skład aktywnego kompleksu rekombinacyjnego przeprowadzającego reakcję między dwoma miejscami loxP?

4 monomery (tetramer)

Jaką rolę w technologii wytwarzania bezresztkowych (gutless) wektorów adenowirusowych III generacji odgrywa układ rekombinacji Cre-loxP?

Wycina sygnał pakowania ψ z wirusa pomocniczego

Która technika oczyszczania wektorów AAV wykorzystuje wysokie, swoiste powinowactwo kapsydu serotypu 2 (AAV2)?

Chromatografia na złożu z heparyną

Która cecha odróżnia lentiwirusy od pozostałych klasycznych retrowirusów gamma pod względem transdukcji komórek docelowych?

Zdolność do wydajnej infekcji komórek niedzielących się

W jaki sposób linia komórkowa HEK-293 umożliwia namnażanie wektorów adenowirusowych I generacji?

Posiada zintegrowany region E1 genomu adenowirusa

Wirusy amfotropowe infekują:

komorki myszy i innych ssaków

Na czym polega zabieg pseudotypowania wektorów lentiwirusowych?

Na zastąpieniu natywnych glikoprotein otoczki Env białkiem otoczkowym pochodzącym z innego wirusa (np. VSV-G)

Sposób/sposoby zapobiegania reaktywacji infekcyjnego retrowirusa to:

A. rozdzielenie sekwencji kodujących białka strukturalne,

B. usunięcie sekwencji pakującej w prowirusie,

Elementy cis zawierają

wszystkie:

A. Kasetę ekspresyjną z transferem

B. Sekwencje pakowania w wiriony

C. Sekwencje odpowiedzialne za integrację wirusowego DNA

Geny env kodują:

Glikoproteiny otoczki wirusowej

Retrowirusy infekują:

A: komórki ulegające podziałom (prawidłowa)

Zalety cechujące wektory retrowirusowe to:

możliwe modyfikacje tropizmu, dzięki fuzji genu env z ligandami receptorów

II Generacja wektorów lentiwirusowych nie zawiera

Genów vif, vpr, vpu i nef

Preferencja miejsca insercji retrowirusa HIV

Wewnątrz miejsc startu transkrypcji

Jakiej cechy nie zaliczamy do wad retrowirusów

Krótka ekspresja transgenu

Cechy idealnego wektora:

● duże miano produkcji,

● trwała i stabilna ekspresja transgenu,

● niska immunogenność,

● swoistość ekspresji i tropizmu,

● duża pojemność,

● integracja z genomem w określonym miejscu lub forma episomalna.

Czym jest komórka pakująca?

Komórka, która zawiera defektywny wirus bez fragmentów niezbędnych do replikacji.

Omów rolę białek regulatorowych Tat w cyklu życiowym wirusa HIV-1

Białko Tat jest niezbędne do stymulacji i aktywacji transkrypcji wirusowego RNA oraz jego wydajnej replikacji, a także wpływa na modyfikację odpowiedzi immunologicznej komórki gospodarza

Wady retrowirusów

○ insercyjna mutageneza

○ Potencjalne niebezpieczeństwo replikacji kompetentnego wirusa

○ Niebezpieczeństwo przedostania się do środowiska

○ Mogą być toksyczne

○ Może zachodzić autonomiczna replikacja

○ Ograniczona wielkość transgenu

○ Częste wyciszania ekspresji, spowodowane przez metylacje sekwencji wirusowych

Czy wbudowanie retrowirusa do genomu jest przypadkowe? Od jakich czynników zależy?

Nie jest przypadkowe, zależy od:

- sekwencji nukleotydowej wektora

- stanu metylacji dinukleotydów typu CpG

- odległości od nukleosomów

- autonomicznej transkrypcji chromatyny

Podaj jaki typ retrowirusa infekuje:

A. wiele komórek różnych ssaków, ale nie myszy, - ksenotropowe

B. komórki myszy oraz innych ssaków - amfotropowe

C. tylko komórki myszy - ekotropowe

Jakie znasz elementy budowy genomu retrowirusa:

○ gag

○ env

○ pol

○ phi

○ LTR 3’ I 5’

Cechy idealnego wektora

wszystkie:

A. swoistość tropizmu oraz ekspresji

B. niska immunogenność

C. infekcyjność komórek postmitotycznych

Retrowirusy zawierają

dwie nici RNA o dodatniej polaryzacji

U retrowirusów dwie nici RNA nie są do siebie komplementarne

PRAWDA

Retrowirusy po wniknięciu do komórek eukariotycznych

wszystkie:

A. używają własnych enzymów

B. używają odwrotną transkryptazę

C. przepisują swoją informację genetyczną na DNA

Retrowirusy integrują się do genomu gospodarza

PRAWDA

Lentiwirusy infekują

komórki dzielące i niedzielące się

Wady retrowirusów

mogą powstać mutacje insercyjne

U retrowirusów region LTR

wszystkie:

A. jest niekodujący

B. zawiera promotor i wzmacniacz transkrypcji

C. jest odpowiedzialny za integrację i regulację transkrypcji

U retrowirusów gen gag

koduje białka rdzenia wirusa

U retrowirusów gen pol

koduje integrazę, proteazę

U retrowirusów gen env

koduje glikoproteiny otoczki wirusowej

U retrowirusów region (psi)

odpowiedzialny jest za pakowanie wirusowego RNA do otoczki

Retrowirus dostaje się do komórki

WSZYSTKIE:

A. poprzez bezpośrednią fuzję błonową

B. na drodze endocytozy
C. za pośrednictwem receptora

Po dostaniu się retrowirusa do komórki

wszystkie:

A. następuje proces odpłaszczania

B. RNA podlega odwrotnej transkrypcji

C. tworzy się prowirusowy dwuniciowy DNA

W genom gospodarza integruje się

Prowirusowy DNA

wiriony potomne opuszczają komórkę

poprzez pączkowanie

Zalety wektorów retrowirusowych

wszystkie:

A. wysoka wydajność w dostarczaniu genów

B. zapewniają umiarkowaną ale długotrwałą ekspresję

C. nie powodują lizy komórek

Wbudowanie się retrowirusa do genomu jest zupełnie przypadkowe

FAŁSZ

Wbudowanie się retrowirusa do genomu zależy od

wszystkie:

A. sekwencji nukleotydowej wektora

B. stanu metylacji dinukleotydów typu CpG

C. odległości od nukleosomów

Wadą wektorów retrowirusowych jest

wszystkie:

A. niebezpieczeństwo replikacji kompetentnego wirusa

B. przedostanie się nowych odmian wirusa do środowiska

C. wystąpienie objawów ubocznych

Aby zapobiegać reaktywacji infekcyjnego retrowirusa w komórkach pakujących stosuje się

wszystkie:

A. różne promotory

B. różne sekwencje terminujące

C. usunięcie sekwencji pakującej

wirusy ekotropowe

infekują tylko komórki myszy

Białko Rev u Lentiwirusów odpowiedzialne jest za

transport cząsteczek mRNA wirusowego z jądra do cytoplazmy komórki

Białko Tat u Lentiwirusów odpowiedzialne jest za

transkrypcję wirusa i jego replikację

Wektory lentiwirusowe mogą infekować komórki nie dzielące się

prawda

Wektory lentiwirusowe infekują komórki nie dzielące się dzięki obecności

wszystkie:

A. białek Vpr

B. kompleksu preintegracyjnego

C. integrazy

Cele modyfikacji rekombinowanych lentiwirusów

wszystkie:

A. unieszkodliwiające wirusa

B. elementy cis niezbędne dla wydajnego wektora

C. wektory samoinaktywujące się

W produkcji wektora lentiwirusowego stosuje się wektor pomocniczy, który

wszystkie:

A. dostarcza geny białek wewnętrznych

B. zawiera sekwencję Ψ

C. nie zawiera genów otoczki wirusa

W produkcji wektora lentiwirusowego stosuje się wektor ekspresyjny, który zawiera

wszystkie:

A. transgen

B. sekwencję pakującą RNA do wirusa

C. promotor pochodzący z innego wirusa

I Generacja wektorów lentiwirusowych zawiera

wszystkie:

A. geny tat and rev

B. Otoczka z genomu VSV-G

C. Geny vif, vpr, vpu i nef

I Generacja wektorów lentiwirusowych zawiera transgen w obrębie genu

env

I Generacja wektorów lentiwirusowych zawiera osobny konstrukt z genem

env

II Generacja wektorów lentiwirusowych nie zawiera

Genów vif, vpr, vpu i nef

II Generacja wektorów lentiwirusowych zawiera osobny konstrukt z genem

env

II Generacja wektorów lentiwirusowych zawiera wektor ekspresyjny z

wszystkie:

A. transgenem

B. regionami LTR

C. region RRE

III Generacja wektorów lentiwirusowych zawiera

4 konstrukty

III Generacja wektorów lentiwirusowych - konstrukt pakujący zawiera

gag/pol

Produkcja lentiwirusów na dużą skalę do zastosowań klinicznych odbywa się

w komórkach pakujących

Pseudotypowanie lentiwirusów stosuje się w celu

zwiększenia tropizmu wirusa

Do pseudotypowania lentiwirusów stosuje się

glikoproteinę G z VSV-G

Do wektorów wirusowych nieintergujących się z genomem gospodarza zaliczamy:

HSV i adenowirusy

integrujące się: retro i lenti-wirusy

który z wymienionych wektorów odznacza się największą pojemnością

HSV

mutageneza insercyjna jest zagrożeniem w przypadku wykorzystania wektora wirusowego z rodzaju

retrowirus

jaka jest najpowszechniejsza metoda oczyszczania wektorów ADv, jaka jest zasada tej metody

wirowanie w gradiencie chlorku cezu - powstaje pierścień, który jest zbierany

opisz w jaki sposób orientacja i lokalizacja loxP określa sposób przegrupowania materiału genetycznego przez rekombinację Cre

Inwersja: 2 loxP są ustawione w przeciwnych kierunkach to DNA zostaje odwrócone. Ilość loxP się nie zmienia

Delecja: Jeśli loxP są ustawione w tym samym kierunku, to DNA między loxP zostaje wycięte. Jeśli dzieje się to na dwóch niciach - translokacja

opisz różnice i podobieństwa między TALEN a ZNF

TALEN rozpoznaje 1 nukleotyd a ZNF 3-4

ZNF powiązane jest z palcami cynkowymi

potrzebują nukleazy do działania np. Fok1

rozpoznają dimery

wymień 4 fizyczne metody transfekcji i opisz dokładnie jedną z nich

• elektroporacja

• ultradźwięki

• mikrowstrzykawka

• gene gun

elektroporacja polega na

wykorzystaniu prądu do wprowadzenia DNA.

• W komórkach poddanych działaniu prądu tworzą się pory w błonie komórkowej, przez co DNA może wejść do komórki.

• napięcie jest ustalane eksperymentalnie i zależy od kom.

• za słabe napięcie sprawia, że pory nie powstają, a za wysokie zabija komórki.

• pory w błonie komórkowej powstaja i szybko znikają

podpisz poniższe rodzaje impulsów elektrycznych i zaznacz ten, który najczęściej wykorzystuje się do kom. ssaczych

opisz czym charakteryzuje się i jak zbudowany jest genom wektora adenowirusowego typu gutless

Wektor typu gutless jest pozbawiony wszystkich wirusowych genów kodujących. Jego genom zawiera wyłącznie krótkie sekwencje regulatorowe zlokalizowane na końcach: odwrócone powtórzenia końcowe (ITR), które są niezbędne do replikacji, oraz sygnał pakowania (PSI) Całkowite usunięcie genów wirusowych sprawia, że wektor ten ma bardzo dużą pojemność, znacznie obniżoną immunogenność oraz pozwala na długotrwałą ekspresję wprowadzonego genu w komórce gospodarza. Do namnożenia w procesie produkcji wymaga obecności wektora/wirusa pomocniczego, który dostarczy białek strukturalnych i replikacyjnych.

czym jest wektor typu shuttle i wektor pomocniczy? jakie geny zawiera?

Wektor shuttle

- Namnaża się w dwóch różnych organizmach (np bakteria i ssak) Geny do namnażania się

- 2x miejsce startu replikacji (ori) i 2x marker selekcyjny (po 1 dla organizmu).

Wektor pomocniczy

- Produkuje białka do budowy wektora wirusowego, ale sam się w niego nie pakuje. Ma geny kodujące białka strukturalne wirusa (ale celowo nie ma sekwencji pakującej) [gag,pol,env ale bez psi]

zaznacz sekwencje, które będą służyły jako startery dla syntezy kompletnej nici DNA

do czego służy białko tet

za replikację, tworzenia odpowiedniego środowiska do tworzenia wirusa

białko rev

– transport cząsteczek mRNA wirusowego z jądra do cytoplazmy komórki poprzez interakcję z wysoce ustrukturyzowaną sekwencją wirusowego RNA - RRE - Rev-responsive element

białko tat

– niezbędne do transkrypcji wirusa i jego replikacji, zmiana odpowiedzi immunologicznej, tworzenie odpowiedniego środowiska do produkcji wirusa Aktywność promotora wirusowego poprzez interakcje z TAR - transactivation response element