Tecnologie del DNA Ricombinante - Applicazioni della PCR

Flashcard di vocabolario e concetti chiave sulle applicazioni avanzate della PCR, inclusi screening di mutazioni, screening di librerie genomiche tridimensionale, ARMS, RT-PCR, clonaggio di ampliconi e strategie di PCR per sequenze ignote (PCR inversa, IRE-PCR, Linker-primed PCR).

Mutation screening

Indagine mediante PCR e sequenziamento (es. Sanger) volta a individuare mutazioni di sequenza non ancora nota all'interno di geni candidati associati a un dato fenotipo o patologia.

Screening di librerie genomiche mediante pooling tridimensionale

Strategia per identificare un clone positivo riducendo le reazioni di PCR: si raggruppano le piastre a 96 pozzetti in pile ($40$ pool primari) e successivamente la pila positiva viene frazionata in sub-pool per piastre ($9$), righe ($8$) e colonne ($12$), trovando il clone con sole $69$ reazioni totali.

Mutation detection

Tecnica mirata a rilevare mutazioni puntiformi note, di cui è già conosciuta la sequenza coinvolta nella malattia, in un numero elevato di individui o campioni clinici.

Mutation detection mediante enzimi di restrizione

Metodo utilizzato quando una mutazione puntiforme nota crea o abolisce un sito di restrizione (come nell'anemia falciforme): dopo l'amplificazione PCR e la digestione con l'enzima, l'elettroforesi rivela una banda per l'allele non tagliato (wildtype) o due bande per l'allele tagliato (mutante).

ARMS (Amplification Refractory Mutation System)

Metodo per discriminare alleli basato su primer allele-specifici che differiscono per la base al terminale $3'$; la Taq polimerasi, priva di correzione di bozze, non innesca la sintesi se l'ultimo nucleotide al $3'$ non è complementare al templato.

RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

Metodica che amplifica indirettamente una molecola di RNA valutando la presenza o il livello di espressione di uno specifico trascritto di mRNA, il quale viene convertito in cDNA a singolo filamento prima della PCR.

Geni housekeeping

Geni di riferimento espressi a livelli costanti utilizzati nella RT-PCR per normalizzare e quantificare accuratamente il livello di espressione del gene bersaglio.

Reazione di controllo No-RT

PCR condotta direttamente sul campione di RNA omettendo la trascrittasi inversa per escludere la presenza di DNA genomico contaminante, poiché la Taq polimerasi non funziona sull'RNA.

T-vectors

Plasmidi linearizzati e ingegnerizzati con una singola timina ($\text{T}$) sporgente al $3'$ del polylinker, compatibili per il clonaggio diretto di amplificati PCR generati da polimerasi con attività terminal-transferasica che aggiunge un'adenina ($\text{A}$) al $3'$.

Inserimento di siti di restrizione nei primer

Modifica effettuata aggiungendo sequenze non appaiate al terminale $5'$ dei primer; durante il primo ciclo non partecipano all'annealing, ma a partire dal secondo ciclo vengono incorporate nel prodotto per facilitare il clonaggio direzionale.

Frequenza di errore della Taq polimerasi

Tasso di errore pari a $1 \times 10^{-4}$, causato dalla totale mancanza di attività esonucleasica di correzione di bozze (proofreading) in direzione $3' \rightarrow 5'$.

PCR inversa

Tecnica usata per amplificare tratti di DNA ignoto contigui a sequenze note; prevede primer inizialmente divergenti disegnati sulla regione nota, digestione con enzima di restrizione e circolarizzazione intramolecolare con ligasi per rendere i primer convergenti.

IRE-PCR (Interspersed Repetitive Elements PCR)

Metodo che impiega primer complementari a sequenze ripetute intersperse (come gli elementi Alu) orientati verso l'esterno per amplificare le regioni di DNA ignoto collocate tra due ripetizioni sufficientemente vicine.

Linker Primed PCR

Tecnica che permette l'amplificazione simultanea di popolazioni complesse di frammenti di DNA a sequenza ignota mediante la ligazione di adattatori oligonucleotidici sintetici a doppio filamento alle loro estremità.

Screening di mutazioni (Mutation Screening)

Indagine su geni candidati potenzialmente associati a patologie o fenotipi per individuare alterazioni genetiche di cui non si conosce ancora a priori la sequenza, realizzata amplificando i singoli esoni (o il cDNA) con primer specifici e analizzandoli mediante sequenziamento Sanger.

Screening tridimensionale di una libreria genomica mediante pooling

Strategia per identificare un clone positivo in una libreria (ad es. 35.000 cloni su 360 piastre da 96 pozzetti distribuite in 40 pile) raggruppando i campioni in pool di pile e poi risolvendo le coordinate spaziali del clone tramite 29 sub-pool (9 di piastra, 8 di riga e 12 di colonna), richiedendo complessivamente solo 69 reazioni di PCR.

Mutation Detection (Rilevazione di mutazioni puntiformi)

Metodologia basata su PCR finalizzata a identificare rapidamente la presenza o l'assenza di mutazioni note in soggetti a rischio o pazienti, partendo dalla conoscenza preliminare dell'esatta sequenza nucleotidica coinvolta.

Rilevazione di mutazioni mediante enzimi di restrizione (PCR-RFLP)

Approccio di mutation detection impiegato quando una mutazione nota genera o abolisce un sito di restrizione (es. anemia falciforme); l'amplificato genico viene trattato con l'enzima di restrizione, producendo all'elettroforesi una singola banda per l'allele wild-type (non tagliato) o due bande per l'allele mutato (tagliato da EcoRI).

ARMS (Amplification Refractory Mutation System)

Metodo per discriminare mutazioni puntiformi prive di siti di restrizione sfruttando l'assenza di attività proofreading della Taq polimerasi, che impedisce l'allungamento se l'ultima base all'estremità $3'$ del primer non è perfettamente complementare al templato, combinando primer allele-specifici con primer aspecifici esterni di controllo.

RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)

Tecnica che quantifica e analizza indirettamente specifiche molecole di mRNA cellulare retrotrascrivendole preventivamente in filamenti di cDNA tramite l'enzima trascrittasi inversa (spesso innescata con oligo-dT), per poi sottoporre il cDNA ad amplificazione convenzionale con PCR.

Controllo per contaminazione da DNA genomico in RT-PCR

Procedura di verifica che prevede l'esecuzione di una PCR di controllo direttamente sul campione di RNA senza eseguire la retrotrascrizione (poiché la DNA polimerasi non usa l'RNA come stampo), oppure il disegno dei primer su due esoni differenti separati da un introne per distinguere le dimensioni dei due diversi amplificati.

Geni housekeeping

Geni costitutivi espressi a livelli costanti utilizzati nella RT-PCR come standard o calibratori interni di riferimento per normalizzare e quantificare l'espressione del gene bersaglio.

Clonaggio in vitro mediante PCR

Metodica per isolare e amplificare selettivamente frammenti di DNA genomico o cDNA, i quali possono essere successivamente inseriti in un vettore plasmidico quando è necessario produrre quantitativi elevati di DNA che la PCR non può raggiungere a causa del plateau.

Attività terminal-transferasica

Attività enzimatica secondaria di alcune DNA polimerasi termostabili che aggiunge un singolo nucleotide deossiadilico ($A$) sporgente all'estremità $3'$ del prodotto di amplificazione.

T vectors

Plasmidi linearizzati appositamente ingegnerizzati con un nucleotide di timidina ($T$) sporgente al $3'$ in corrispondenza del polylinker, consentendo il clonaggio coesivo diretto dei frammenti di PCR che presentano adenina sporgente al $3'$.

Tasso di errore della Taq polimerasi

Frequenza di mutazione e di errata incorporazione pari a $1 \times 10^{-4}$, imputabile alla totale assenza dell'attività esonucleasica di correzione delle bozze (proofreading) in direzione $3' \rightarrow 5'$.

Primers modificati con code di restrizione al $5'$

Oligonucleotidi recanti all'estremità $5'$ sequenze artificiali contenenti siti di restrizione (es. EcoRI, XhoI) non complementari al templato nel primo ciclo, ma che vengono stabilmente incorporate nei filamenti duplicati a partire dal secondo ciclo di PCR.

PCR Inversa (Inverse PCR)

Metodo per amplificare sequenze di DNA ignote adiacenti a un tratto noto mediante l'uso iniziale di primer divergenti, i quali diventano convergenti dopo digestione enzimatica e successiva circolarizzazione intramolecolare del frammento operata dalla DNA ligasi a concentrazioni diluite.

IRE-PCR (Interspersed Repetitive Elements PCR)

Tecnica che sfrutta elementi genomici altamente ripetuti e interdispersi (tipicamente sequenze Alu vicine tra loro) per ancorare primer specifici e consentire l'amplificazione della sequenza ignota compresa tra due di queste unità ripetute.

Linker Primed PCR

Procedura di PCR per l'amplificazione globale di miscele complesse di DNA non caratterizzato (es. DNA genomico totale), in cui si legano corti adattatori oligonucleotidici sintetici a doppio filamento alle estremità dei frammenti per innescare la reazione con primer ad essi complementari.