KOLOS 2 - CAŁA prezentacja

Transkrypcja

DNA przepisuje się na mRNA

Translacja

mRNA służy do zrobienia białka.

Zmiany epigenetyczne i nieepigenetyczne

• metylacja sekwencji promotorowej

• działanie czynników transkrypcyjnych

• dostępność chromatyny

Zmiany potranskrypcyjne

• splicing alternatywny

• stabilność i degradacja mRNA

• wyciszanie przez miRNA

Zmiany potranslacyjne

• fosforylacja

• glikozylacja

• ubikwitynacja i degradacja białka

Co to jest promotor?

Fragment DNA, który wskazuje, gdzie rozpocząć transkrypcję genu.

Co to jest metylacja DNA?

Dołączenie grup metylowych (CH₃) do DNA. Może wyciszać gen.

Co to są egzony?

Fragmenty genu, które pozostają w dojrzałym mRNA po wycięciu intronów.

Co oznacza 5′ cap?

Ochronna czapeczka na początku mRNA, która pomaga chronić je i uczestniczy w rozpoczęciu translacji.Ochronna czapeczka na początku mRNA, która pomaga chronić je i uczestniczy w rozpoczęciu translacji.Ochronna czapeczka na początku mRNA, która pomaga chronić je i uczestniczy w rozpoczęciu translacji.

Co to jest fosforylacja białka?

Dołączenie grupy fosforanowej do białka, które może zmienić jego działanie.

Techniki oceny ekspresji genów: mRNA

• Northern blot ( metoda hybrydyzacyjna )

• PCR ( powielenie badanej sekwencji DNA )

Techniki oceny ekspresji genów: Białko

• Western blot ( immunodetekcja )

Northern blot ( metoda hybrydyzacyjna )

• Wykrycie badanej sekwencji RNA unieruchomionego na membranie poprzedzone elektroforetycznym rozdziałem RNA w żelu agarozowym.

• Wykorzystuje sondy specyficznie wiążące się do badanej sekwencji.

PCR ( powielenie badanej sekwencji DNA )

• Wykorzystuje zasadę komplementarności zasad azotowych.

Western blot ( immunodetekcja )

• Wykrycie białka unieruchomionego na membranie poprzedzone elektroforetycznym rozdziałem białek w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących.

• Wykorzystuje przeciwciała specyficzne wobec badanego białka.

Wykorzystanie kwasów nukleinowych - ograniczenia

• warunki środowiskowe

• “wiek” próbki

• zanieczyszczenie materiału

Warunki środowiskowe - wykorzystanie DNA

• wilgotność

• promieniowanie

• temp

• inne metody analizy kryminalistycznej

Zanieczyszczenie materiału - wykorzystanie DNA

• obecność bakterii i grzybów

• obecność bezkręgowców

ANALIZY RNA W BIOLOGII KRYMINALISTYCZNEJ - Ocena stopnia degradacji RNA

• Ocena czasu zgonu

• Ocena wieku śladu znalezionego na miejscu zdarzenia

ANALIZY RNA W BIOLOGII KRYMINALISTYCZNEJ - Ekspresja genów tkankowo specyficznych

• Ocena pochodzenia tkanki

• Ocena rodzaju wydzieliny

Ocena pochodzenia tkanki

mózg

serce

płuca

mięśnie szkieletowe

Ocena rodzaju wydzieliny

krew

krew menstruacyjna

mocz

wydzieliny nosowe

sperma

ślina

ANALIZY RNA W BIOLOGII KRYMINALISTYCZNEJ - Zmiany w ekspresji genów specyficznych dla procesu

Ocena wieku rany

ANALIZA EKSPRESJI GENÓW - od próbki do wyniku

1. Pobranie i zabezpieczenie

2. Izolacja RNA

3. Usunięcie gDNA

4. Ocena ilości i jakości

5. Odwrotna transkrypcja

6. qPCR

7. Analiza danych

1. Pobranie i zabezpieczenie

Stabilizacja RNA (np. RNAlater), zamrożenie, warunki wolne od RNaz

2. Izolacja RNA

TRI reagent, rozdział faz, oczyszczanie na kolumienkach

3. Usunięcie gDNA

Trawienie DNazą I; kontrola bez odwrotnej transkryptazy

4. Ocena ilości i jakości

A260, A260/280, A260/230, RIN

5. Odwrotna transkrypcja

Synteza cDNA na matrycy RNA

6. qPCR

Pomiar fluorescencji w każdym cyklu

7. Analiza danych

Ct, normalizacja do genu referencyjnego, 2−ΔΔCt

IZOLACJA RNA - 1.TRI reagent

• Fenol, alkohol izoamylowy, β-merkaptoetanol, chlorowodorek/izotiocyjanian guanidyny

• Liza komórek

• Denaturacja białek – inhibicja RNaz

IZOLACJA RNA - 2. Fenol Chloroform

Rozdział faz:

• faza wodna (RNA)

• interfaza (większość DNA)

• faza organiczna (ciała komórek, białka)

IZOLACJA RNA - 3. Izopropanol Etanol

Wytrącenie i oczyszczenie RNA

IZOLACJA RNA - 4. Woda

Elucja RNA

Wykorzystanie RNA zanieczyszczonego izotiocyjanianem guanidyny spowoduje

denaturację enzymów katalizujących reakcje PCR

Zebranie do fazy wodnej interfazy bądź fazy organicznej skutkuje

izolacją DNA wraz z RNA bądź zanieczyszczeniem próbki białkami

Po etapie wytrącenia RNA izopropanolem najczęściej wprowadza się

do procedury użycie kolumienek

W celu lepszego oczyszczenia RNA można powtórzyć

etap płukania etanolem

IZOLACJA RNA - Tkanki ( złożoność próbki )

Heterogenne – różne typy komórek, macierz zewnątrzkomórkowa, białka, lipidy

IZOLACJA RNA - Tkanki ( obecność struktur utrudniających izolację )

Dużo kolagenu, tłuszczu, włókien, nukleaz

IZOLACJA RNA - Tkanki ( aktywność RNaz )

Bardzo wysoka – szczególnie w tkankach wątroby, trzustki, śledziony

IZOLACJA RNA - Tkanki ( jakość izolowanego materiału )

Często niższa (częściowa degradacja

IZOLACJA RNA - Linie komórkowe - złożoność próbki

Homogenne – jeden typ komórek, brak macierzy

IZOLACJA RNA - Linie komórkowe - Obecność struktur utrudniających izolację

Wyłącznie komórki hodowlane

IZOLACJA RNA - Linie komórkowe - Aktywność RNaz

Zazwyczaj niższa, łatwiejsza kontrola RNaz

IZOLACJA RNA - Linie komórkowe - Jakość izolowanego materiału

Zazwyczaj wysoka (RIN > 8)

IZOLACJA RNA - Wymagana modyfikacjametody dla tkanek - Złożoność próbki, Obecność struktur utrudniających izolację

Potrzeba homogenizacji materiałuliza chemiczna (bufor TRIzol) i mechaniczna (homogenizator/moździerz w ciekłym azocie)

IZOLACJA RNA - Wymagana modyfikacjametody dla tkanek - Jakość izolowanego materiału, Aktywność RNaz

Szybsze zabezpieczenie materiału po pobraniu/sprawna izolacja

IZOLACJA RNA - tkanki

IZOLACJA RNA - linie komórkowe

IZOLACJA RNA - Wymagana modyfikacjametody – dla tkanek

ZABEZPIECZENIE RNA - stabilizacja próbki i usunięcie gDNA

• Przed izolacją: ochrona przed RNazami

• Po izolacji: usunięcie DNA genomowego

Przed izolacją: ochrona przed RNazami

• RNazy są wszechobecne i stabilne: rękawiczki, odczynniki i materiały wolne od RNaz, osobne stanowisko pracy

• Stabilizacja tkanki: odczynnik typu RNAlater lub natychmiastowe zamrożenie w ciekłym azocie

• Przechowywanie RNA w −80°C, bez wielokrotnego rozmrażania

• Ślady biologiczne: zabezpieczać wysuszone, w niskiej temperaturze; wysoka temperatura i duże wahania temperatury oraz wilgoć przyspieszają degradację

Przed izolacją: ochrona przed RNazami ( RNazy są wszechobecne i stabilne )

rękawiczki, odczynniki i materiały wolne od RNaz, osobne stanowisko pracy

Przed izolacją: ochrona przed RNazami (Stabilizacja tkanki)

odczynnik typu RNAlater lub natychmiastowe zamrożenie w ciekłym azocie

Przed izolacją: ochrona przed RNazami (Przechowywanie RNA w −80°C)

bez wielokrotnego rozmrażania

Przed izolacją: ochrona przed RNazami (Ślady biologiczne)

zabezpieczać wysuszone, w niskiej temperaturze; wysoka temperatura i duże wahania temperatury oraz wilgoć przyspieszają degradację

Po izolacji: usunięcie DNA genomowego

• gDNA w próbce zawyża wynik pomiaru stężenia RNA• gDNA w analizie RT-PCR daje fałszywie dodatni sygnał

• Trawienie DNazą I (na kolumience lub w roztworze), a następnie inaktywacja enzymu

• Kontrola „−RT” (bez odwrotnej transkryptazy): brak sygnału potwierdza brak gDNA

Po izolacji: usunięcie DNA genomowego - gDNA w próbce

zawyża wynik pomiaru stężenia RNA

Po izolacji: usunięcie DNA genomowego -gDNA w analizie RT-PCR

daje fałszywie dodatni sygnał

Po izolacji: usunięcie DNA genomowego - Trawienie DNazą I

(na kolumience lub w roztworze), a następnie inaktywacja enzymu

Po izolacji: usunięcie DNA genomowego - Kontrola „−RT”

(bez odwrotnej transkryptazy): brak sygnału potwierdza brak gDNA

OCENA ILOŚCIOWA I JAKOŚCIOWA RNA

• Ocena stężenia RNA (Metoda spektrofotometryczna)

• Ocena czystości RNA (Metoda spektrofotometryczna)

• Ocena jakości RNA (Metoda elektroforetyczna)

OCENA ILOŚCIOWA I JAKOŚCIOWA RNA - Ocena stężenia RNA (Metoda spektrofotometryczna)

Pomiar absorbancji przy długości fal 260 nm (A260) – maksimum absorbancji dla kwasów nukleinowych

OCENA ILOŚCIOWA I JAKOŚCIOWA RNA - Ocena czystości RNA (Metoda spektrofotometryczna)

Maksimum absorbancji przy długości fal:

260 nm kwasy nukleinowe

280 nm białka

230 nm związki wykorzystywane do izolacji RNA

Współczynnik A260/A280 1,8 – 2,0 zanieczyszczenie białkami

Współczynnik A260/A230 1,90 – 2,25 zanieczyszczenie np. izotiocyjanianem

Współczynnik A260/A280 1,8 – 2,0

zanieczyszczenie białkami

Współczynnik A260/A230 1,90 – 2,25

zanieczyszczenie np. izotiocyjanianem

OCENA ILOŚCIOWA I JAKOŚCIOWA RNA - Ocena jakości RNA (Metoda elektroforetyczna)

• Densytometryczna ocena jakości prążków odpowiadających 28S i 18S rRNA (A) –stosunek intensywności prążków 28S:18S rRNA zbliżone 2:1 – najlepsza jakość, brak degradacji im mnieszy stosunek, tym większa degradacja;

• Ocena współczynnika RIN (ang. RNA integrity number; B) 10 – 1 (10 = niski stopień degradacji, 1 = wysoki poziom degradacji)

Jak oceniamy jakość RNA na podstawie prążków 28S i 18S rRNA?

Stosunek 28S:18S ≈ 2:1 oznacza najlepszą jakość. Im mniejszy stosunek, tym większa degradacja RNA.

Czym jest RIN i co oznaczają jego wartości?

RIN ocenia jakość RNA w skali 1–10. 10 = najlepsza jakość, 1 = największa degradacja

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI - zasada

Metoda odwzorowująca proces naturalnie występujący podczas infekcji wirusami RNA

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI - Produkt reakcji

Tworzenie cDNA (komplementarne DNA) na matrycy RNA

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI - Enzym

Udział odwrotnej transkryptazy(polimerazy DNA zależnej od RNA)

ETAPY REAKCJI ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI

1. Przyłączenie starterów

2. Synteza cDNA

3. Dezaktywacja enzymu

1. Przyłączenie starterów

oligo(dT), heksamery lub swoiste

2. Synteza cDNA

wydłużanie nici cDNA (zwykle 42–50 °C)

3. Dezaktywacja enzymu

inaktywacja termiczna enzymu (np. 85 °C)

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI - skład mieszaniny reakcyjnej

1. Enzym – odwrotna transkryptaza

2. Bufor reakcyjny

3. Startery

4. dNTPs

5. Matryca

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI Skład mieszaniny reakcyjnej - enzym

Polimeraza DNA zależna od RNA

• Pochodzenie wirusowe (AMV – wirus ptasiej białaczki lub MMLV – wirus mysiej białaczki Moloneya)

• Optimum temperatury: około 37– 55°C

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI Skład mieszaniny reakcyjnej - Bufor reakcyjny

Utrzymuje odpowiednie pH reakcji (pH około 8,0– 8,5)

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI Skład mieszaniny reakcyjnej - Startery

Krótkie fragmenty DNA wiążące komplementarnie matrycę RNA:

• primery oligo(dT) (matryca: mRNA)

• losowe heksamery (matryca: total RNA)

• specyficzne dla sekwencji startery (matryca: badana sekwencja)

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI Skład mieszaniny reakcyjnej - dNTPs

Substrat do syntezy cDNA

• Równe stężenie każdego z trifosforanów deoksyrybonukleoty dów (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), zazwyczaj 0,5–1,0 mM

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI Skład mieszaniny reakcyjnej - Matryca

RNA wysokiej jakości (niezdegradowany)

• RNA wolny od zanieczyszczeń (w tym DNA)

• 100–1000 ng RNA / reakcję

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI - przebieg reakcji

1. Denaturacja i przyłączenie starterów

2. Synteza cDNA

3. Inaktywacja enzymu

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI - przebieg reakcji ( 1. Denaturacja i przyłączenie starterów )

65°C 5 min

• Denaturacja RNA – usunięcie struktur II-rzędowych

• Przyłączenie starterów do sekwencji matrycowej

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI - przebieg reakcji (2. Synteza cDNA)

37–55°C 10–60 min

• Synteza cDNA

• Synteza w kierunku 5′ → 3′

REAKCJA ODWROTNEJ TRANSKRYPCJI - przebieg reakcji (3. Inaktywacja enzymu)

70–85°C 5–15 min

• Inaktywacja odwrotnej transkryptazy

Polimerase Chain Reaction - PCR ( zasada )

Metoda odwzorowująca naturalnie występujący proces replikacji DNA

Polimerase Chain Reaction - PCR (amplifikacja)

Amplifikacja DNA z wykorzystaniem syntetycznych starterów komplementarnych względem badanej sekwencji

Polimerase Chain Reaction - PCR (pomiar)

endpoint - pomiar po zakończeniu reakcji

real-time - pomiar w każdym cyklu amplifikacji

POWTARZALNE CYKLICZNIE ETAPY REAKCJI - pcr

Denaturacja DNA

Przyłączenie starterów

Synteza DNA

kolejny cykl ( liczba kopii rośnie wykładniczo )

WYKORZYSTANIE PCR

Diagnostyka - wykrywanie ekspresji markerów chorób

Rolnictwo - wykrywanie ekspresji genów warunkujących większą odporność na warunki środowiskowe

Biologia kryminalistyczna - ocena płci biologicznej

PCR - skład mieszaniny reakcyjnej:

1. enzym - polimeraza DNA

2. Bufor reakcyjny

3. dNTPs

4. Startery

5. Matryca

PCR - skład mieszaniny reakcyjnej (Enzym-polimeraza DNA)

• Aktywność polimerazowa w kierunku 5′ → 3′

• Termostabilna polimeraza z bakterii termofilnych: Thermus aquaticus – polimeraza Taq lub Pyrococcus furiosus – polimeraza Pfu

• Polimeraza inaktywowana (np. przez przyłączenie termolabilnych przeciwciał) – tzw. hot start

PCR - skład mieszaniny reakcyjnej (bufor reakcyjny)

• Utrzymuje odpowiednie pH reakcji (pH około 8,5 – 9,0)

• Zawiera jony dwuwartościowe (Mg2+)

PCR - skład mieszaniny reakcyjnej (dNTPs)

• Substrat reakcji

• Równe stężenie każdego z trifosforanów deoksyrybonukleoty dów (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), zazwyczaj 0,5 – 1,0 mM

PCR - skład mieszaniny reakcyjnej (Startery)

• Oligonukleotydy DNA o długości 15 – 30 pz

• Specyficznie wiążą się do badanej sekwencji na podstawie komplementarności zasad

PCR - skład mieszaniny reakcyjnej (Matryca)

• DNA wysokiej jakości i czystości

• DNA genomowe, cDNA

USTALANIE WARUNKÓW PCR - etapy krytyczne (Mg2+)

• Stężenie kluczowe ze względu na wpływ na aktywność polimerazy

– zbyt niskie stężenie → niewydajna amplifikacja, brak produktu

– zbyt wysokie stężenie → niespecyficzne produkty