Cellbiologi 1

Primärkultur

-Celler tagna direkt från vävnad

-Kan sättas i nytt odlingsmedium för massframställning

-De flesta celler kan endast dela sig ett begränsat antal gånger (40-60x) i människor

-Ofta ganska oförändrade jämfört med cell-linjer (naturlig fenotyp)

Cell-linjer

-Delar sig obegränsat antal gånger

-Ofta framställda från tumörer/stamceller

-I regel dedifferentierade och på andra sätt förändrade

Olika typer av ljusmikroskopi

1. Ljusfältsmikroskopi

2. Faskontrast/DIC

3. Fluorescensmikroskopi

4. Konfokalmikroskopi

Ljusfältsmikroskopi

Vanligt ljusmikroskop

Faskontrast/DIC

Gör levande celler synliga utan färgning

Fluorescensmikroskopi

-Märker strukturer med fluroforer

-Excitationsljus får fluoroforen att absrobera energi som sedan avges som emissionsljus

-GFP (Green Fluorescent Protein) är en fluorofor som lyser grönt när det belyses med blått ljus

-Genmodifiering kan få specifik celltyp att producera GFP

Konfokalmikroskopi

Skannar prover punkt för punkt i flera olika nivåer för att ge en 3D-bild

Olika typer av elektronmikroskopi

-Transmissions-elektronmikroskopi (TEM)

-Ser inre struktur

-Scanning elektronmikroskopi (SEM)

-Ser ytstruktur

FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting)/flödescytometri

Kan användas för att isolera olika cellpopulationer som sedan analyseras

Cell-fraktionering

Protokoll för att sortera cellens komponenter

En mikroskopibild är inte bevis i sig själv

-Måste kvantifieras och kontrolleras

T.ex: Fluorescensintensitet, cellstorlek, migrationshastighet etc.

Homeobox-gener

-En grupp gener som kodar för homeo-domänproteiner som fungerar som transkriptionsfaktorer

-Reglerar uttrycket av gener under utvecklingen, t.ex. differentiering av kroppsegenskaper och specificering av kroppsaxlar

-Finns hos alla eukaryoter

HOX-gener

-Undergrupp av Homeobox-gener

-Gemensamma för de flesta organismer

-Kontrollerar utvecklingen av det centrala nervsystemt samt segmenterade kroppsstrukturer (extermiteter, revben, ryggkotor etc.)

Modellorganismer och exempel på användning

-Jäst: Cellcykel-kontroll och celldelning

-Grönalg: Kloroplaster och fotosyntes

-Nematod (C. elegans): Utvecklingsbiologi, exakt 959 st. celler

-Bananfluga: Utvecklingsbiologi

-Planaria: Stamceller

-Zebrafisk: Utvecklingsbiologi

-Mus: Ärftlighet

-Växter: Utvecklingsbiologi + Jordbrukets tillämpningar

Lipid-dubbelskikt

Två lager av fosfolipider där de hydrofoba svansarna pekar inåt mot varandra och de hydrofila huvudena pekar utåt mot vatten

Cellmembranets struktur

-Lipid-dubbelskikt med inbäddade proteiner

-Förstärks av underliggande cell-kortex

-Cellytan är täckt av kolhydrater (glykoproteiner, glykolipider)

Fosfolipider struktur

-Glycerol + Fosfat + Huvudgrupp (hydrofila)

-Två fettsyror (hydrofoba)

Amfipatisk

En molekyl som har både hydrofil och hydrofob del

Tvådimensionell vätska

Beskriver hur lipider och proteiner rör sig fritt i planet (x-y) men inte uppåt/nedåt

Var börjar membranbildningen?

Endoplasmatiska retiklet (ER)

Vanligaste fosfolipiden i cellmembranet?

Fosfatidylkolin

Kolesterolets påverkan i cellmembranet

Gör membranet stelare under högre temperaturer och gör det mer fluid under lägre temperaturer

Hur rör sig fosfolipider i ett membran?

1. Lateralt (sida till sida)

2. Rotation (snurrar runt sin egen axel)

3. Flexion (svansarna böjer och vibrerar)

4. Flip-flop (up/ner)

-Ovanligt, involverar oftast ett enzym

Membransyntes - början till slut

1. Startar i ER

-Nybildade fosfolipider anläggs på den cytosoliska sidan

-Scramblaser flyttar fosfolipider slumpmässigt mellan lagren (kräver inte energi)

2. Nya fosfolipider anländer till Golgi via vesiklar

-Flippaser flyttar fosfatidylserin och fosfatidyletanolamin till den cytosoliska sidan (assymetri)

-Kräver energi

-Membranet kröker sig

3. Fosfolipiderna kan flyttas vidare till plasmamembranet via vesiklar

Scramblaser

-Enzymer som slumpmässigt flyttar fosfolipider mellan ett membrans två lager

-Kräver ingen energi

-Finns framförallt i ER

Flippaser

-Enzymer som selektivt flyttar fosfatidylserin och fosfatidyletanolamin till cytosoliska lagret

-Kräver energi

-Finns framförallt i Golgi+Plasmamembran

Glykolipider

Lipider med kolhydratkedjor på den extracellulära sidan

Assymetrisk fördelning av membran

-Glykolipider, neutrala lipider, och sfingomyelin finns mest på utsidan

-Negativt laddade och konformade lipider finns mest på insidan

Lipiders orientering i membranet

Behålls när de flyttas mellan ER, Golgi och plasmamembranet

"Lipid rafts"

Kolesterol, glykolipider och sfingomyelin ansamlas i specifika områden

-Plattformar för signalering

Hur är membranproteiner förankrade?

1. Transmembrana segment - integrerad (oftast via alfa-helix)

2. Lipid-länkad - integrerad

3. Perifert via andra proteiner

Varför korsar en polypeptidkedja vanligtvis lipid-dubbelskiktet som en helix?

-Peptidkedjornas skelett är hydrofila

-Lösningen är att bilda en alfa-helix med hydrofoba sidokedjor på utsidan

Poriner i bakterier och organeller

Nästan alltid beta-flak och inte alfa-helixar

Hur bildas en hydrofil por?

Flera alfa-helixar med hydrofila sidokedjor pekade innåt och hydrofoba sidokedjor pekandes utåt

Receptorer

Membranproteiner som binder ligander och initierar signalering (tar emot information)

Kanaler

Membranproteiner som bildar utrymmen för passiv transport av joner eller vatten

-Selektiva

Transportörer

Membranproteiner som flyttar molekyler över membranet antingen via faciliterad diffusion eller aktiv transport

Enzymer (membran)

Membranbundna proteiner som katalyserar reaktioner vid membranet

Kortex

Nätverk på insidan av membranet byggd av bl.a. proteinerna aktin, spektrin och myosin

-Ger membranet form och stabilitet

Detergenter

Solubiliserar membranproteiner genom att ersätta lipiderna runt proteinets hydrofoba delar och bildar vattenlösliga detergent-protein-miceller

Hur fungerar plasmamembranet hos tarmepitelceller

Tight junctions begränsar rörelsen/håller kvar membranproteiner i deras respektive domäner

-> Olika sidor av samma cell kan ha specifika funktioner

Glykokalyx

Tjockt lager av socker på utsidan av cellmembranet

-Består av glykoproteiner, glykolipider, proteoglykan

-Skyddar cellen, celligenkänning

Hur kan man mäta membranproteiners rörlighet/diffusion?

FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)

FRAP metod

1. Man märker membranproteiner med fluorescens

2. Man "bleker" ett litet område med en laser

3. Fluorescensen återkommer när nya, oblekta proteiner diffunderar in i området

Snabb återkomst -> Proteiner rör sig snabbt

Långsam återkomst -> Proteiner rör sig långsamt eller är fast förankrade

Hur tar sig olika molekyler in och ut ur cellen?

-Vatten: Passiv transport genom aquaporiner (kanalprotein)

-Joner: 1. Passiv transport via selektiva jonkanaler. 2. Aktiv transport via pumpar.

Passiv transport

Utan energiförbrukning, nedför sin koncentrations- eller elektrokemiska gradient

Diffusion

Förflyttning av partiklar längs sin koncentrationsgradient,

hög -> låg

Kanaler vs Transportörer

Kanaler

-Passiv

-Snabb

-Specifika

-Skiftar slumpmässigt mellan öppna och stängda tillstånd men påverkas av olika stimuli (t.ex. membranpotential)

Transportörer

-Passiv ELLER aktiv

-Långsammare

-Specifika

-Genomgår konformationsändring för varje molekyl/jon

Aquaporin

Kanalproteiner för transport av vatten

-Finns olika sorter vad gäller permeabilitet, reglering och lokalisering i cell/vävnad

Osmos

Diffusion av vatten över semipermeabelt membran

-Från låg koncentration av lösta ämnen till högre koncentration lösta ämnen

Aktiv transport

Transport mot koncentrations- eller elektrokemisk gradient

-Kräver energi

Elektrokemisk gradient

Kombinerade effekten av:

1. Koncentrationsgradient (kemisk)

2. Membranpotentialen (elektrisk)

Membranpotential

Den elektriska spänningskillnaden mellan cellens insida och utsida

Osmotisk potential

Mått på tendensen för vatten att röra sig in i en lösning via osmos

-Negativ potential som blir mer negativ ju högre koncentration av lösta ämnen som finns i lösningen

Vattenpotential =

Osmotisk potential + Tryckpotential

Olika typer av stimuli som jonkanaler svarar på

1. Membranpotential (spänningsstyrd)

2. Ligand

3. Mekanisk

Normala jonkoncentrationer utanför & innanför djuceller

Innanför:

Na+ 10 mM

K+ 140 mM

Cl- 4 mM

Utanför:

Na+ 145 mM

K+ 5 mM

Cl- 110 mM

Hur är jonkanaler selektiva?

Selektionsfiltret i jonkanalen är anpassat för att stabilisera en specifik sorts jon när den dehydratiseras

-Andra joner kan inte ersätta vattenskalet på ett energimässigt fördelaktigt sätt

-Olika kemiska föreningar används för den anpassade jonen t.ex. karbonylgrupper, hydroxylgrupper

Hur fungerar transmembranpumpar?

Jon binder -> ATP används för att pumpen ska genomgå en konformationsändring och vrida sin struktur så att jonen hamnar på andra sidan, mot sin koncentrationsgradient

Hur fungerar Na+/K+ -pumpen?

-1 ATP används för att köra ut 3 Na+ ur cellen följt av 2 K+ in i cellen

-Båda ämnen mot sin elektrokemiska gradient

-Resultatet blir en mer negativ membranpotential

Hur fungerar SERCA(Ca2+)-pumpen i muskler?

SERCA-pumpen använder 1 ATP för att flytta 2 Ca2+ från cytoplasman in i lumen hos bl.a. sarkoplasmatiska retikulumet

Uniport

Transport av ett enda ämne åt ett håll

-Passiv eller aktiv

Symport

Transport av två olika ämnen åt samma håll över membranet

-Sekundär aktiv transport

T.ex. Na+ pumpas ut för att sedan driva in H+/Glukos

Antiport

Transport av två olika ämnen åt motsatta håll

-Sekundär aktiv transport

T.ex. Na+ pumpas ut för att sedan driva ut Ca2+/H+

Hur går glukostransport från tarm till blodomlopp till?

1. Na+ -driven symport av glukos in i epitelcellen från tarmen

2. Passiv glukos uniport in i blodet (GLUT2)

Kontraktila vakuoler

Vissa sötvattenlevande protister kan aktivt transportera överskottsvatten från cytoplasman tack vare särskilda organeller (=kontraktila vakuoler) via membranvesiklar

Bärartransportörer för glukos

GLUT-familjen

-Alltid med koncentrationsgradienten (passiv)

-När glukos binder förändras proteinets konformation, vilket driver transporten

-Olika GLUT-proteiner har olika Km (Michaelis konstant)

-Vissa sitter stabilt i plasmamembranet, andra fritt cirkulerande i cellen

ABC-transportörer

Stor familj membrantransportproteiner som kräver ATP-hydrolys för transport av ämnen genom membran

Olika typer av ATP-drivna pumpar

1. V-typ (Vakuol-typ)

2. P-typ (Phosphorylation-type)

V-typ ATPaser

-Pumpar H+ in i lysosomer/endosomer för lågt pH

-ATP hydrolyseras vilket driver rotationen av pumpen (som ATP-syntas) men ingen fosfatgrupp fäster

-För att undvika en positiv membranpotential flödar anjoner (ofta Cl-) in för att neutralisera lösningen, så att mer H+ kan pumpas in

P-typ ATPaser

-Pumpar H+ OCH andra joner (t.ex. gör magsaften sur)

-Pumpen fosforyleras själv vilket orsakar en konformationsändring

Vilken laddning har membranpotentialen hos celler i regel?

Negativ (ca. -70 mV)

Hur bildas/upprätthålls vilopotentialen hos celler?

-Na+/K+ -ATPas åstadkommer jongradient

-Selektivt utflöde av K+ (öppna kanaler) medan Na+ hålls inne (stängda kanaler)

-Na+ -gradienten används för andra transporter via symport och antiport

Hur kan jongradienter över plasmamembranet driva aktiv transport?

Na⁺‑gradienten som Na⁺/K⁺‑pumpen skapar används av symporter och antiporter för att aktivt transportera andra ämnen

Aktionspotential

Snabb förändring i membranpotentialen som rör sig som en våg längs en nervcells axon

Alt. En elektrisk signal

Depolarisering

Membranet blir mindre negativt (mer positivt) p.g.a. Na⁺-inflöde

Jonkanalernas roll vid överföringen av nervimpulser

Viloläge: K⁺-kanaler öppna, Na⁺-kanaler stängda.

1. Vid en nervsignal öppnas spänningsstyrda Na⁺-kanaler och natriumjoner strömmar in i cellen.

-Insidan blir mer positiv = Depolarisering.

2. K⁺-joner strömmar ut för att återställa vilopotentialen. Samtidigt påverkar depolariseringen nästa Na⁺-kanal längre fram i axonet, som öppnas.

3. Varje Na⁺-kanal inaktiveras automatiskt efter en viss tid, vilket stoppar den från att kunna öppnas igen på en stund.

-Gör att aktionspotentialen endast går framåt längs axonet.

Rollen av natrium/kaliumpumpen i nervceller

Upprätthåller och återställer jongradienterna

Syfte med Patch-Clamp-teknik

Undersöka elektrisk ström hos liten uppsättning/enstaka jonkanaler via en tunn glas-pipett

-Pipetten innehåller lösning som liknar cytosolens sammansättning

Kan undersöka t.ex. hur ofta kanalen öppnas och stängs, hur mycket strömmar igenom etc.

Olika konfigurationer av Patch-Clamp-tekniken

1. "Cell-attached method"

-Man sätter pipetten mot cellmembranet utan att "störa" cellen.

2. "Detached patch (cytoplasm exposed) method"

-Man sliter loss membranbiten med kanal/kanalerna så att den omges av provets lösning.

-Kan nu kontrollera den intracellulära sidan.

3. "Whole cell recording"

-Man bryter hål på membranet under pipetten och gör pipettens insida kontinuerligt kopplad till cellens cytosol.

-Kan mäta hela cellens jonströmmar

-Kan kontrollera intracellulära miljön via pipettlösningen

Acetylkolins roll

-Signalsubstans (ligand) som öppnar specifika jonkanaler

-Används ofta i forskning med t.ex. Patch-Clamp-tekniken

Optogenetik

Metod för att styra nervceller med ljus

-Genen för ljuskänsligt kanalprotein (opsin) stoppas in i virus och viruset injiceras i hjärnan på mus

-Valda neuroner börjar uttrycka opsinet

-En 'optrod' förs in till hjärnområdet man vill studera

-Ljussignaler öppnar jonkanaler och neuronen aktiveras

Katabolism

Katabola vägar frigör energi genom att bryta ner komplexa molekyler till enklare

-T.ex. Cellandning (nedbrytning av glukos i närvaro av O2)

Anabolism

Anabola vägar förbrukar energi för att bygga komplexa molekyler från enklare

-T.ex. Glukoneogenes (Glukos byggs upp från laktat)

Termodynamikens första och andra lag

1. Energin i universum är konstant, kan endast omvandlas från en form till en annan

2. Universum strävar efter ökad entropi (oordning)

Entropi

Mått på graden av oordning

Entalpi

Energi hos ett system som kan avges/tas upp i form av värme (vid konstant tryck)

Varför behöver celler energi mest fundamentalt?

För att upprätthålla en hög grad av ordning (motverka entropi)

GIbbs fria energi

Delen av ett systems energi som kan användas för att utföra arbete vid konstant tryck och temperatur

-Talar om spontanitet av reaktion

Gibbs fria energi formel

ΔG = ΔH − TΔS

Redoxreaktion

Reaktion där ett ämne oxideras (avger elektroner) och ett ämne reduceras (tar upp elektroner)

Aktiveringsenergi

Den energi som krävs för att nå övergångstillståndet i en reaktion

-Bestämmer hur snabbt reaktionen sker

Energibärare

Molekyl som lagrar och överför energi genom sina kemiska bindningar

ATP-hydrolys - hur genereras energi

Produkterna ADP + Pi är mer stabila (lägre G) än ATP och därmed frias energi när de bildas

Hur används NADH respektive NADPH

NADH är främst invovlerad i katabola reaktioner (t.ex. celladningen) medan NADPH främst används i anabola reaktioner (t.ex. nukleotidsyntes, fettsyrasyntes)

Vad gör Acetyl-CoA till en högenergimolekyl?

Tioesterbindningen mellan Acetyl och S frigör en stor mängd energi när den hydrolyseras

Fotosyntesens två delreaktioner

1. Ljus-beroende klyvning av vatten

2. Ljus-oberoende fixering av koldioxid

Hur är fotosyntesen en redox-process?

H₂O oxideras och CO₂ reduceras

Kloroplastens struktur

-Omgiven av dubbelmembran och inuti finns stroma, utrymmet där calvin-cykeln sker

-I stromat ligger membranblåsor som kallas tylakoider, och dessa är staplade i pelare som kallas granum (plural: grana)

-I tylakoidmembranet sitter pigmentet klorofyll, som fångar ljus

Feofytin (del av reaktionscentret i PSII - immobil)

Den första elektronacceptorn efter P680 som tar emot den exciterade elektronen